Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
Терминология 10
1.1. Устойчивость растений к болезням 11
1.2. Индуцированная устойчивость растений, ее виды 15
1.2.1. Системная приобретенная устойчивость 15
1.2.2. Системная устойчивость, индуцируемая ризосферними бактериями 17
1.2.3. Спектр генов арабидопсиса, экспрессируемых при активации защитных ответов на некрозообразующий патоген, салициловую кислоту, метилжасмонат и этилен 20
1.3. Элиситоры устойчивости растений к болезням 21
1.3.1. Элиситоры общих защитных отетов растений 22
1.3.1.1. Флагеллин 22
1.3.1.2. Бактериальный фактор элонгации. 23
1.3.1.3. Бактериальные белки холодового шока 23
1.3.1.4. Консервативная область трансглютаминаз видов рода Phytophthora - пептид Рер-13 25
1.3.1.5. Липополисахариды 25
1.3.1.6. Пептидил-пролил цистрансизомераза ю бактерии P. Jluorescens. 27
1.3.1.7. Хитин и хитозаны 27
1.3.2. Элиситоры устойчивости растений, участвующие в процессе взаимодействия растение - патоген 27
1.3.2.1. Факторы авирулентности 27
1.3.2.2. Харпины 28
1.4. Механизмы распознавания растением химических детерминант микроорганизмов... 30
1.4.1. Молекулярные детерминанты патогена, PAMPs 30
1.4.2. Распознавание PAMPs у животных и растений 32
1.4.3. Распознавание растением факторов авирулентности патогена 36
1.4.4. Доступность PAMPs для растений 39
1.5. Практическое применение индуцированной устойчивости растений для их защиты от
болезней 39
1.5.1. Обработка растений индукторами устойчивости 39
1.5.2. Создание трансгенных растений, устойчивых к фитопатогенам 40
1.5.2.1. Экспрессия в трансгенных растениях генов антимикробных веществ 42
1.5.2.2. Экспрессия в растениях R-генов близкородственных растений 43
1.5.2.3. Экспрессия в растениях генов элиситоров, вызывающих реакцию СВЧ 44
Глава 2. Материалы и методы исследований. 46
2.1. Материалы 46
2.1.1. Химические реактивы и ферменты, использованные в работе 46
2.1.2. Бактериальные штаммы. 48
2.1.3. Плазмиды 48
2.1.4. Фитопатогенные микроорганизмы . 48
2.1.5. Пептид cspl5 49
2.1.6. Суспензионная культура клеток табака 49
2.2. Методы 50
2.2.1. Трансформация табака методом «листовых дисков» 50
2.2.2. Генетический анализ трансгенных растений поколения ТІ 51
2.2.3. Выделение растительной геномной ДНК 52
2.2.4. Полимеразная цепная реакция 52
2.2.5. Выделение тотальной РНК. 53
2.2.6. Анализ экспрессии CspD гена на уровне синтеза мРНК с помощью обратной транскрипции с последующей ПЦР. 54
2.2.7. Определение уровня экспрессии целевого гена с помощью ПЦР в реальном времени. 54
2.2.8. Выращивание трансгенных растений табака в климатической камере 56
2.2.9. Культивирование гриба Alternaria longipes (Ellis &Everh.) 56
2.2.10. Оценка трансгенных растений табака на устойчивость к патогенному грибу A. longipes. 56
2.2.11. Оценка трансгенных растений табака на устойчивость к вирусу табачной мозаики 57
2.2.12. Оценка активности пептида csp!5 в системе табак - ВТМ 57
2.2.13. Изучение скорости СВЧ реакции в тканях картофеля при несовместимом взаимодействии после обработки пептидом cspl5 58
2.2.14. Изучение влияния пептида cspl5 на прорастание спор гриба Stagonospora nodorum 58
2.2.15. Проверка активности пептида cspl5 с использованием пары пшеница - возбудитель септориоза (5. nodorum) 58
2.2.16. Инфильтрация пептида cspl5 в межклеточное пространство листьев табака 60
2.2.17. Определение содержания салициловой кислоты в тканях картофеля, обработанных пептидом cspl5 60
2.2.18. Измерение защелачивания питательной среды в суспензионной культуре клеток табака после обработки элиситором 61
Результаты исследований и их обсуждение 62
Глава 3. Анализ нуклеотидной и аминокислотной последовательностей гена и белка MF2 (CspD, номер в GenBank AY272058) 62
3.1. Анализ первичной структуры нуклеотидной и аминокислотной последовательностей гена и белка MF2 62
3.2. Анализ нуклеотидной последовательности гена CspD с целью определения возможности его эффективной экспрессии в растениях табака 64
Глава 4. Получение трансгенных растений табака с геном CspD. Биотесты с трансгенными растениями 69
4.1. Конструирование бинарного вектора pBilt7, несущего бактериальный ген CspD, для трансформации растений 69
4.2. Агробактериальная трансформация 71
4.3. Молекулярный анализ трансгенных растений 72
4.4. Сравнение уровня экспрессии в трансгенных линиях табака с помощью ПЦР в реальном времени 75
4.5. Определение числа локусов в геноме растений, в которые произошла вставка Т-ДНК. Наследование вставки в поколении ТІ 77
4.6. Оценка устойчивости трансгенных растений табака 80
4.6.1. Оценка трансгенных растений табака на устойчивость к патогенному грибу A. longipes. 80
4.6.2. Оценка трансгенных растений табака на устойчивость к вирусу табачной мозаики 82
Глава 5. Изучение элиситорных свойств пептида cspl5 87
5.1. Исследование способности пептида cspl5 индуцировать устойчивость в системах
растение-хозяин - патоген 87
5.1.1. Оценка активности пептида cspl5 в системе табак -ВТМ 89
5.1.2. Изучение скорости СВЧ реакции в тканях картофеля при несовместимом взаимодействии с патогеном после обработки пептидом cspl5 90
5.1.3. Изучение влияния пептида csp!5 на прорастание спор S. nodorum 91
5.1.4. Проверка защитной активности пептида cspl5 в паре пшеница -5. nodorum 91
5.2. Изучение защитных реакций растения в ответ на обработку пептидом cspl5 93
5.2.1. Инфильтрация пептида csp 15 в межклеточное пространство листьев табака для обнаружения его способности вызывать реакцию СВЧ 94
5.2.2. Анализ содержания салициловой кислоты в тканях картофеля, обработанных пептидом cspl5 .95
5.2.3. Оптимизация методики тестирования ранних защитных ответов растения в суспензионной культуре клеток табака. Проверка активности пептида cspl5 в культуре клеток табака. 96
Выводы 99
Список опубликованных работ по теме диссертации
