Введение
ГЛАВА 1. Овзор литературы
1.1. Дезоксирибонуклспновыс кислоты, связанные с поверхностью клеток 18
1.1.1. Общие свойства ДНК с клеточной поверхности 9
1.1.2. Взаимодействие ДНК с потенциальными мишенями на поверхности клеток
1.2. Синтетические молекулы ДНК, формирующие комплексы с клеточными белками 32
1.2.1. "ДНК-ловушки" - регуляторы экспрессии генов 18
1.2.2. ДНК-аптамеры, ингибирующие функции белков 21
1.2.3. ДНК-аптамеры к поверхностным маркерам эукариотических клеток 26
1.2.4. Особенности последовательностей ДНК, эффективно связывающихся с эпитопами клеточной поверхности и проникающих в клетки
1.3. Эидотслиальныс клетки — удобная модель для исследования
внеклеточных ДНК, связанных с поверхностью клеток
1.3.1. Общее строение эндотелиоцитов 33
1.3.2. Функции, рецепторы и секреторные белки эндотелиальных клеток 34 Заключение 37
ГЛАВА 2. Материалы и методы 38
2.1. Материалы
2.2. Олигонуклеотиды
2.3. Методы
2.3.1. Клегки и условия их культивирования
2.3.2. Электрофорез Д11К и ОДІ I
2.3.3. Выделение ДНК и ОДЫ из геля при помощи электроэлюции
2.3.4. Получение трипсинового элюата с поверхности клеток .
2.3.5. Активация сефарозы CL-4B бромцианом .
2.3.6. Выделения ДНК из нуклеопротеиновых комплексов трипсинового элюата клеток 42
2.3.7. Получение и выделение [32Р] - меченых ОДН и фрагментов ДНК 43 44
2.3.8. Получение двуцепочечных адаптеров
2.3.9. Лигирование фланкирующих ОДН к 5 - и 3- концам модельного ОДН
2.3.10. Лигирование фланкирующих ОДН к 3 - и 5 - концам [32Р] - меченых
оцДНК
2.3.11. ПЦР-амплнфикация продуктов лигпропания и выделение ПЦР продуктов из реакционной смеси 45
2.3.12. Наработка клеток E.coli штамм JM 109 для трансформации
2.3.13. Трансформация клеток E.coli плазмидной ДНК
2.3.14. Выделение плазмидной ДНК из клеток E.coli
2.3.15. Подготовка плазмиды pBlueScript II KS и ПЦР-нродуктов для лигирования по липким концам 47
2.3.16. Цитирование ПЦР-продуктов в плазмиду pBlueScript II KS но липким концам 47
2.3.17. Получение супернатантов для определения распределения [32Р] меченых олигонуклеотидов в клетках 48
2.3.18. Выделение ДИК и определение концентрации при помощи флуоресцентного метода 49
2.3.19. Выделение РНК из мембранпо-цитозольной фракции эукариотических клеток на стекловолокннстых сорбентах 49
2.3.20. Экспрессия тканеспецифических генов и культуре эукариотических клеток 50
2.3.21. Подготовка слайдов для флуоресцентной микроскопии
2.3.22. Подготовка слайдов для хромосомного анализа эндотелиальиых клеток 52
2.3.23. Подготовка образцов для исследования накопления олигонуклеотидов, модифицированных флуоресцеином, в клетках при помощи проточной цитометрии 52
ГЛАВА 3. Результаты экспериментов и их обсуждение 54
3.1. Введение 54
3.2. Культивирование и характернзации эндотелиальиых клеток человека
3.3. Исследование ннзкомолекулярных ДИК, связанных с поверхностью эндотелноцитов 59
3.4. Разработка методологии выделения коротких ДНК, "прочно" связанных е поверхностью клеток 60
3.5. Разработка протокола лигирования фланкирующих ОДН к оцДНК в условиях низких концентраций оцДНК-мшнсней 64
3.6. Выделение, амплификация, клонирование и секвенпровапне коротких ДНК с клеточной поверхности эндотелноцитов 74
3.7. Исследование связывания коротких олигонуклеотидов с эндотелиальнымп клетками 81
3.8. Компьютерный анализ геномной ДНК человека и выявление участков ДНК, содержащих кластеры отсеквеннрованных ДНК мотивов 4
3.9. Взаимодействие с эндотелиоцитамн олигонуклеотидов, содержащих отсеквеннрованнме ДНК мотивы 95
3.9.1. Исследование взаимодействия [32Р]-меченых олигонуклеотидов с эндотелиальнымп клетками
3.9.2. Исследование взаимодействия олигоиуклсотидов с клетками методами флуоресцентной микроскопии и прогонной цнтоф. иоорометрии 102
Заключение 112
Выводы из список сокращений 114
Список литературы
