Введение
ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ 10
Актуальность проблемы 10
Цель и задачи исследования 14
Научная новизна 15
Положения, выносимые на защиту 16
Научно-практическая ценность 16
Апробация работы 17
Реализация результатов исследования 18
Структура и объём диссертации 19
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 20
2.1. Опыты на животных 20
2.1.1. Объекты исследования 20
2.1.2. Хирургические вмешательства 20
2.1.2.1. Операции на седалищном нерве 20
2.1.2.2. Овариэктомия 22
2.1.3. Фармакологические воздействия 22
2.1.3.1. Неорганическое железо (FeCl3) и железотранспортирующий белок трансферрин 22
2.1.3.2. 17Р-эстрадиол и селективные модуляторы рецепторов эстрогенов (тамоксифен и аналог ралоксифена LY117018) 22
2.1.3.3. Фармакологические воздействия в экспериментах по изучению ретроградного аксонного транспорта 23
2.1.3.4. Короткая интерферирующая РЬЖ в исследованиях синтеза белка
в аксоне 24
2.1.4. Поведенческий тест 24
2.2. Гистологические методы 26
2.2.1. Полутонкие срезы 26
2.2.2. Выявление активности АТФазы миозина 27
2.2.3. Иммуногистохимические методы 28
2.2.3.1. Скелетные мышцы крыс и морских свинок 30
2.2.3.2. Спинной мозг и седалищный нерв мышей 30
2.2.4. Морфометрический анализ Fluorogold-позитивных мотонейронов 31
2.3. Иммуноблотинг 33
2.4. Методы исследования экспрессии генов 35
2.4.1. Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией 35
2.4.2. Полимеразная цепная реакция в реальном времени 37
2.4.3. Матричная гибридизация комплементарной ДНК 37
2.5. Радиоавтографические методы 38
2.5.1. Радиоиммунологический метод определения концентрации 17р-эстрадиола в сыворотке крови 38
2.5.2. Радиоавтографический метод выявления 17Р-эстрадиола в нервной ткани 39
2.6. Статистическая обработка результатов 39
ГЛАВА 3. ВЛИЯНИЕ АГОНИСТОВ РЕЦЕПТОРОВ ЭСТРОГЕНОВ НА ПОСТТРАВМАТИЧЕСКУЮ РЕГЕНЕРАЦИЮ ПЕРИФЕРИЧЕСКОГО НЕРВА 40
3.1. Уоллеровская дегенерация и регенерация периферического нерва 40
3.2. Нейропротекторное действие эстрогенов 43
3.3. Влияние 170-эстрадиола на регенерацию седалищного нерва у овариэктомированных мышей 45
3.3.1. Восстановление функционального индекса седалищного нерва 46
3.3.2. Морфометрический анализ регенерации седалищного нерва 48
3.3.3. Иммуноэкспрессия Hsp25 в поясничном отделе спинного мозга 51
3.4. Влияние селективных модуляторов рецепторов эстрогенов на
регенерацию седалищного нерва у овариэктомированных мышей 52
3.4.1. Селективные модуляторы рецепторов эстрогенов 52
3.4.2. Влияние тамоксифена на восстановление функционального индекса седалищного нерва у овариэктомированных мышей 55
3.4.3. Влияния LY117018 на регенерацию седалищного нерва у овариэктомированных мышей 56
3.5. Заключение 60
ГЛАВА 4. ВЛИЯНИЕ 17Р-ЭСТРАДИОЛА НА ЭКСПРЕССИЮ ГЕНОВ В ПОЯСНИЧНОМ ОТДЕЛЕ СПИННОГО МОЗГА 63
4.1. Эстрогеновый комплекс в регуляции экспрессии генов 63
4.2. Экспрессия рецепторов эстрогенов в мотонейронах 66
4.2.1.ИммуноэкспрессияЕКаиЕК|3 66
4.2.2. Экспрессия мРНК ERa и ERp в поясничном отделе спинного мозга .68
4.3. Модуляция экспрессии генов в поясничном отделе спинного мозга овариэктомированных мышей 74
4.4. Заключение 86
ГЛАВА 5. ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ЭКСПРЕССИЯ РЕЦЕПТОРОВ СОСУДИСТОГО ЭНДОТЕЛИАЛЬНОГО ФАКТОРА РОСТА И ЭНДОТЕЛИНОВ В МОТОНЕЙРОНАХ СПИННОГО МОЗГА МЫШИ... 89
5.1. Экспрессия сосудистого эндотелиального фактора роста и его рецепторов Flt-І и Flk-І 89
5.1.1. Нейропротекторная роль сосудистого эндотелиального фактора
роста 89
5.1.2. Роль VEGF/Flt-І сигнального каскада в аксотомированных мотонейронах мышей-самцов 91
5.1.3. Влияние эстрогенов на экспрессию VEGF у овариэктомированных мышей 94
5.2. Экспрессия рецепторов эндотелинов ЕТД и ЕТВ 98
5.2.1. Нейропротекторное действие эндотелинов 98
5.2.2. Активация эндотелин/ЕТв системы в мотонейронах спинного мозга у мышей-самцов после одностороннего передавливания седалищного нерва 99
5.3. Заключение 102
ГЛАВА 6. РОЛЬ ЭСТРОГЕНОВ В РЕГУЛЯЦИИ МЕХАНИЗМОВ РЕТРОГРАДНОГО АКСОННОГО ТРАНСПОРТА 107
6.1. Альтернативный механизм действия эстрогенов 107
6.2. Методы исследования аксонного транспорта 109
6.2.1. Механизмы регуляции аксонного транспорта 109
6.2.2. Ход эксперимента 110
6.3. Экспрессия, локализация и транспорт рецепторов эстрогенов в периферическом нерве 112
6.3.1. Иммуноэкспрессия ERa и ER(3 в седалищном нерве 112
6.3.2. Аксонный транспорт рецепторов эстрогенов 115
6.4. Влияние 17р-эстрадиола и аналога ралоксифена LY117018 на ретроградный аксонный транспорт 115
6.4.1. Системное и локальное воздействие 17|3-эстрадиола на аксонный транспорт 115
6.4.2. Локальное воздействие аналога ралоксифена LY117018 на аксонный транспорт 119
6.5. Роль эстрогенов в ERK-зависимом механизме регуляции ретроградного аксонного транспорта 120
6.5.1. Исследование роли PI 3-К и МАРК в регуляции аксонного транспорта 120
6.5.2. Влияние аксотомии на активацию ERK 122
6.5.3. Влияние 17р-эстрадиола на иммуноэкспрессию фосфо-ERK в спинном мозге и седалищном нерве 124
6.6. Заключение 127
ГЛАВА 7. ЭСТРОГЕНЫ И ВНУТРИАКСОННЫИ СИНТЕЗ БЕЛКА 130
7.1. Синтез белка в аксоне 130
7.1.1. РНК — компонент аксоплазмы 131
7.1.2. Аксонный транспорт и локальный синтез белка 133
7.1.3. РНК-интерференция в изучении трансляции белка 134
7.2. Влияние локального синтеза Р-тубулина на эффективность ретроградного аксонного транспорта 136
7.2.1. Ход эксперимента 136
7.2.2. Влияние интерферирующей РНК, комплементарной мРНК нейрональной формы р-тубулина, на ретроградный аксонный транспорт 137
7.3. Влияние 17Р-эстрадиола на ретроградный аксонный транспорт в присутствии ингибитора синтеза белка циклогексимида 142
7.4. Заключение 143
ГЛАВА 8. ПЛАСТИЧНОСТЬ ФЕНОТИПА СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ В УСЛОВИЯХ ДЕНЕРВАЦИИ 146
8.1. Диагностика типов мышечных волокон 147
8.2. Регуляция фенотипа мышечных волокон 148
8.2.1. Влияние трёхвалентного железа и трансферрина на пластичность камбаловидной мышцы крысы после перерезки седалищного нерва 150
8.2.2. Камбаловидная мышца морской свинки после перерезки седалищного нерва и аппликации на нерв колхицина 152
8.2.3. Влияние трансферрина на иммуногистохимические характеристики камбаловидной мышцы морской свинки после блокады аксонного транспорта 155
8.3. Пластичность скелетных мышц опытной и контралатеральной конечностей после одностороннего повреждения седалищного нерва 156
8.3.1. Камбаловидные мышцы опытной и контралатеральной конечностей при различных способах денервации 156
8.3.2. Червеобразные мышцы опытной и контралатеральной конечностей при различных способах денервации 158
8.4. Заключение 160
ГЛАВА 9. ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ И ВЫВОДЫ 162
Выводы 164
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 166
