Оглавление.........................................................................................................2
Список сокращений ............................................................................................4
1. Введение.........................................................................................................5
2. Обзор литературы .........................................................................................15
2.1. Развитие технологии редактирования генома: мегануклеазы, ZFN, TALEN,
CRISPR/Cas ...................................................................................................16
2.2. История открытия CRISPR/Cas9...............................................................19
2.3. Характеристика систем CRISPR/Cas.........................................................21
2.4. Механизм работы CRISPR-систем............................................................25
2.5. Система CRISPR/Cas9 как инструмент редактирования генома .................32
2.6. Перспективы и ограничения системы CRISPR/Cas9 для редактирования
генома человека .............................................................................................35
2.7. Разработка геномных редакторов следующего поколения .........................42
2.8. Saccharomyces cerevisiae как модельный объект для редактирования генома
......................................................................................................................49
3. Материалы и методы.....................................................................................50
3.1. Материалы ..............................................................................................50
3.2. Методы ...................................................................................................51
3.2.1. Условия культивации микроорганизмов..............................................51
3.2.2. Амплификация фрагментов усовершенствованных форм Cas9 и ПЦРмутагенез....................................................................................................52
3.2.3. Электрофорез фрагментов ДНК в агарозном геле ................................52
3.2.4. Сборка высокоспецифичных вариантов Cas9.......................................53
3.2.5. Трансформация дрожжевых клеток.....................................................53
3.2.7. Выделение плазмидной ДНК из дрожжей ...........................................55
3.2.8. Приготовление химических компетентных клеток E. coli и
трансформация плазмидной ДНК ................................................................56
3.2.9. Выделение плазмидной ДНК из бактерий ...........................................573
3.2.10. ПЦР-анализ плазмидной ДНК...........................................................58
3.2.13. Оценка активности полученных форм Сas9 .......................................59
3.2.14. Оценка специфичности полученных форм Сas9.................................59
3.2.15. Молекулярно-динамическое моделирование структур Cas9 ...............60
3.2.16. Статистический анализ.....................................................................61
4. Результаты и обсуждение ..............................................................................62
4.1. Получение тест-системы для скрининга новых вариантов Cas9.................62
4.2. Комбинации аминокислотных замен, повышающих специфичность и
эффективность редактирования ДНК, позволяют оптимизировать свойства Cas9
......................................................................................................................70
4.3. Повышение активности новых форм Cas9 путем случайного мутагенеза ...80
4.4. Повышение целевой активности высокоспецифичных форм Cas9 методом
рационального дизайна ..................................................................................86
5. Заключение...................................................................................................99
Выводы .......................................................................................................101
Список литературы.........................................................................................102
Приложения.................................................................................................126
