Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. Активные формы кислорода в организме 8
1.1.1. Пероксид водорода 8
1.1.2. Супероксидный анион - радикал 9
1.1.3. Синглетный кислород 9
1.1.4. Гидроксил радикал 10
1.1.5. Оксид азота 10
1.2. Цитотоксическое действие активных форм кислорода в организме 12
1.3. Антиокислительная защита организма 14
1.3.1. Механизмы внутриклеточной антиокислительной защиты 14
1.3.1.1. Супероксиддисмутаза 15
1.3.1.2. Каталаза 16
1.3.1.3. Пероксидаза 18
1.3.1.4. Глутатион зависимые ферменты 19
1.3.2. Механизмы неферментативной природы 21
1.4. Иммуноглобулины 23
1.5. Каталитически активные антитела 26
1.5.1. Природные каталитически активные антитела при различных аутоиммунных патологиях 28
1.5.2. Возможные механизмы образования природных абзимов 29
1.5.3. Природные абзимы с протеазной активностью 32
1.5.4. Природные абзимы с нуклеазными активностями 33
1.5.5. Природные абзимы с другими активностями 32
1.5.6. Абзимы с оксидоредуктазной активностью 35
1.6. Доказательство принадлежности каталитических активностей антителам 41
2. Экспериментальная часть 44
2.1 Реактивы и материалы 44
2.2. Методы 45
2.2.1. Получение сыворотки крови 45
2.2.2. Вьщеление антител из плазмы крови крыс аффинной хроматографией на Protein A-Sepharose 45
2.2.3. Очистка IgG с помощью гель-фильтрации 45
2.2.4. Электрофоретический анализ белков - 45
2.2.5. Концентрирование препаратов белка 46
2.2.6. Определение концентрации белка 46
2.2.7. Определение пероксидазной и оксидоредуктазной активностей антител 46
2.2.8. Иммунизация кроликов 47
2.2.9. Определение оптимального значения рН в реакции окисления Диаминобензидина (DAB) антителами 48
2.2.10. Тестирование пероксидазной и оксидоредуктазной активностей белков в полиакриламидном геле 48
2.2.11. Проведение рН-шока антител 49
2.2.12. Исследование влияние ионов двухвалентных металлов на пероксидазную и оксидоредуктазную активности антител 49
2.2.13. Определение каталазной и глутатионпероксидазной активностей AT 50
2.2.14. Определение кинетических параметров реакции окисления субстрата антителами 50
2.2.15. Анализ содержания металлов в препаратах антител 50
2.2.16. Хроматография AT на сорбенте, хелатирующем ионы металлов 51
2.2.17. Определение пероксидазной и оксидоредуктазной активностей методом флуоресценции 51
3. Результаты и их обсуждение 53
3.1. Выделение препаратов антител из сыворотки крови крыс линии Wistar 55
3.2. Тестирование пероксидазной и оксидоредуктазной активностей в препаратах антител 56
3.3. Определение оптимальных условий реакции окисления диаминобензидина антителами 63
3.3.1. Исследование зависимости пероксидазной активности от рН среды 63
3.3.2. Зависимость пероксидазной активности от концентрации пероксида водорода 65
3.4. Доказательство принадлежности каталитической активности антителам 66 3.4.1. Кислый шок препаратов антител 67
3.5. Локализация активных центров антител 71
3.5.1. Тестирование пероксидазной и оксидоредуктазной активностей методом in situ 73
3.6. Влияние ионов двухвалентных металлов на пероксидазную и оксидоредуктазную активности антител 77
3.6.1. Анализ содержания металлов в препаратах антител 83
3.6.2. Хроматографическое разделение IgG на сорбенте, хелатирующем ионы металлов 87
3.7. Субстратная специфичность IgG при окислении различных соединений 97
3.7.1. Окисление различных субстратов препаратами антител 104
4. Выводы 109
5. Список литературы 110
