Введение
Часть I. Обзор литературы по теме диссертационной работы .
Глава 1.1. Типы стволовых клеток и источники их выделения.
1.1.1. Основные характеристики стволовых клеток. 12
Концепция существования стволовых клеток. 12
Способность к дифференцировке. 14
Трансдифференцировка. 17
1.1.2. Эмбриональные стволовые клетки. 17
История открытия эмбриональных стволовых клеток. 17
Общая характеристика эмбриональных стволовых клеток . 20
1.1.3. Фетальные стволовые клетки. 24
Источники феталъных стволовых клеток. 24
Фетальные пренатальные стволовые клетки. 26
Фетальные перинатальные стволовые клетки. 27
1.1.4. Региональные стволовые клетки. 34
Мезенхимальные стволовые клетки. 35
Нейроналъные стволовые клетки. 38
Гемопоэтические стволовые клетки. 40
Клетки-предшественники эндотелия. 43
Индуцированные плюрипотентные клетки. о
Глава 1.2. Области применения клеточной терапии.
1.2.1. Перспективы медицинского применения клеточных до материалов мезенхимального происхождения.
Лечение заболеваний опорно-двигательного аппарата. 49
Применение КМ мезенхимального происхождения в неврологии.
Применения КМ мезенхимального происхождения при восстановлении повреждений сердца и лечения сердечно- сосудистых заболеваний. Использование КМ мезенхимального происхождения для лечения заболеваний печени.
Иммуномодулирующие свойства клеточных материалов мезенхимального происхождения .
Применение клеточных материалов мезенхимального происхождения в эстетической медицине, а также для лечения заболеваний кожи.
1.2.2. Современное состояние законодательной базы в области производства, стандартизации и применения клеточных материалов.
Отсутствие понятия «клеточный материал» в базовых законах Российской Федерации, регулируюгцих производство клеточных материалов.
Создание законодательной базы в области производства, „ стандартизации и применения клеточных материалов.
Международные нормы правового регламентирования ,п
деятельности в области клеточных технологий.
Часть II. Материалы и методы исследований.
Глава III. Методы культивирования клеток.
II. 1.1. Получение первичных культур мезенхимальных клеток. 64
Выделение фибробластов из кожи человека. 64
Выделение кератиноцитов из кожи человека. 64
Выделение мезенхимальных клеток из костного мозга человека.
Выделение мезенхимальных клеток из плаценты человека. 65
Выделение мезенхимальных клеток из пуповины человека .
II 1.2. Культивирование первичных клеточных культур , мезенхимального происхождения in vitro.
Пассирование мезенхимальных клеток. 66
Долговременная криоконсервация клеток. 66
Определение концентрации клеток в камере Горяева. 66
II. 1.3. Дифференцировка клеток мезенхимального происхождения in vitro.
Остеогенная дифференцировка мезенхимальных стволовых ,.„ клеток человека.
Хондрогенная дифференцировка мезенхимальных стволовых ,„ клеток человека.
Адипогенная дифференцировка мезенхимальных стволовых ,„ клеток человека.
Глава II.2. Биохимические и цитологические методы .
II.2.1. Биохимические методы. 69
Окраска исключающим витальным красителем трипановым синим.
Индикация дегидрогеназной активности с помощью калориметрического МТТ-теста.
Индикация фосфата кальция методом окрашивания . по Ван Коссу.
Индикация коллагена методом окрашивания толуидиновым синим.
Индикация липидов методом окраски масляным красным. 72
II.2.2. Цитогенетические методы. 72
Получение препаратов для цитогенетического анализа . 72
Анализ хромосомного состава клеток.
II.2.3. Иммуноцитохимические методы. 73
Иммуноцитохимическая детекция поверхностных и „
внутриклеточных маркёров.
Иммуноцитохимическая детекция маркёров клеточной „.
дифференцировки.
Проточная цитофлуориметрия. 75 Часть III. Результаты и обсуждение.
Глава III.1 . Оптимизация технологии получения и культивирования клеточных материалов мезенхимального происхождения .
111.1.1. Оптимизация-технологии получения клеточных „,
материалов мезенхимального происхождения.
Особенности выделения фибробластов кожи человека. 16
Особенности выделения мезенхималъных стволовых клеток й» из костного мозга человека.
Особенности выделения мезенхималъных стволовых клеток ос из плаценты человека.
Особенности выделения мезенхималъных стволовых клеток из пуповины человека.
III. 1.2. Изучение особенностей морфологии клеток мезенхимального происхождения в процессе культивирования in vitro.
Морфологическая гетерогенность вследствие наличия исходной примеси клеток других тканей.
Морфологическая гетерогенность вследствие наличия фибробластоподобных клеток мезенхимального происхождения различной степени зрелости.
Глава ІII.2. Оптимизация методов контроля качества клеточных материалов мезенхимального происхождения .
2.1. Подтверждение мезенхимальной природы выделенных клеток.
Определение фенотипа выделенных клеток. 101
Подтверждение мулътипотентности выделенных клеток путём остеогенной, хондрогенной и адипогенной дифференцировки.
2.2. Применение МТТ-метода для определения изменений дегидрагеназнои активности в процессе пассирования клеточных культур.
Необходимость экспериментальной верификации зависимости уровня измеряемого сигнала от количества жизнеспособных клеток в МТТ-методе.
Экспериментальное изучение зависимости уровня измеряемого сигнала от количества жизнеспособных 123
клеток в МТТ-методе. Исследование МТТ-продуктивности клеточных культур в зависимости от пассажа.
III.2.3. Разработка методики кариотипирования при малом количестве митозов.
Обоснование кариотипирования при малом количестве митозов.
Оптимизация методики кариотипирования при малом количестве митозов для монослойной клеточной культуры без открепления её от подложки.
Анализ стабильности кариотипа в процессе пассирования клеточной культуры.
III.2.4. Паспортизация клеточных материалов мезенхимального происхождения.
Общая структура паспорта клеточного материала. 140
Исключение инфекционных агентов в клеточном материале.
Формы паспортов клеточных материалов мезенхимального происхожден ия.
Глава III.3. Оптимизация методов хранения и транспортировки клеточных материалов мезенхимального происхождения .
III.3.1. Криоконсервация клеточных материалов. 147
Подбор среды для криоконсервации клеточных материалов. 147
152 155 155
176
Оптимизации процесса подготовки и накопления клеточных материалов после криоконсервации.
III.3.2. Транспортировка клеточных материалов. 155
Подбор среды и температурного режима транспортировки клеточных материалов.
Подбор контейнера для транспортировки клеточных материалов.
Выводы. 180
Список научных публикаций по теме диссертации. 181
Список использованной литературы. 187
Список использованных сокращений
