Введение
Обзор литературы 10
1. Пространственная организация генома человека 10
1.1. Упаковка генетического материала в клеточном ядре 10
1.1.1. Нуклеосомный уровень компактизации 12
1.1.2. Фибрилла диаметром 30 нм 12
1.1.3. Петельно-доменныи уровень компактизации хроматина 13
1.2. Структура хроматиновых петель 13
1. 3. Ядерный матрикс 15
1.4. Методы изучения доменной структуры генома 17
1.4.1. Экстракция при высокой ионной силе 17
1.4.2. LIS-экстракция 18
1.4.3. Электроэлюция 18
1.4.4. Связывание с ядерным матриксом (скэффолдом) in vitro 19
1.4.5. Расщепление топоизомеразой II ядерного матрикса 20
1.4.6. Флуоресцентная гибридизация in situ 20
1.5. Петлевые домены и функциональная активность генома 21
1.5.1. Петлевые домены и транскрипция 21
1.5.2. Петлевые домены и репликация 22
1.5.3. Различные типы прикрепления ДНК к ядерному матриксу 23
2. Картирование геномов 25
2.1. Физическое картирование генома 25
2.2. Виды физических карт генома 26
2.2.1. Цитогенетические карты 26
2.2.2. Рестрикционные карты 27
2.3. Вектора, используемые для создания библиотек геномов 28
2.3.1. Дрожжевые искусственные хромосомы - YAC вектора 30
2.3.2. Векторная система бактериофага Р1 32
2.3.3. ВАС и РАС вектора 32
2.4. CpG островки 34
3. Локус хромосомы человека 16q22.1 37
3.1. LCAT генный кластер 37
3.2. Гены-супрессоры рака молочной железы на хромосоме человека 16q22.1 38
Материалы и методы 42
1. Материалы 42
1.1. Реактивы 42
1.2. Ферменты 42
1.3. Питательные среды 42
1.4. Библиотеки генома человека 42
1.5. Пробы, применявшиеся при построении интеграционной карты региона хромосомы человека 16q22.1 43
1.6. Пробы, применявшиеся для флуоресцентной гибридизации in situ 48
2. Методы 49
2.1. Выделение РАС ДНК 49
2.2. Субклонирование фрагментов ДНК РАС клонов 49
2.3. Приготовление геномной ДНК лимфоцитов человека, заключенной в агарозные блоки 50
2.4. Расщепление заключенной в агарозные блоки ДНК рестриктазами 50
2.5. Пульс электрофорез 51
2.6. Перенос ДНК на нейлоновый фильтр (блоттинг) 51
2.7. Радиоактивное мечение фрагментов ДНК 51
2.8. Гибридизация с радиоактивно меченым зондом 52
2.9. Программное обеспечение 53
2.10. Выделение лимфоцитов человека для приготовления препаратов ядерного гало и метода ДНК-комет 53
2.11. Электрофорез единичных клеток (метод ДНК-комет) 54
2.12. Флуоресцентная гибридизация in situ с препаратами ДНК-комет 55
2.13. Приготовление препаратов ядерного гало 55
2.14. Флуоресцентная гибридизация in situ с препаратами метафазных хромосом и препаратами ядерного гало 56
Результаты и обсуждение 58
1. Построение интеграционной физической и функциональной карты локуса q22.1 хромосомы человека 16 58
1.1. Картирование представленных в виде геномных библиотек участков ДНК локуса хромосомы человека 16q22.1 58
1.2. Построение геномной карты локуса 63
1.3. Локализация принадлежащих локусу CpG островков 63
1.4. Выявление генов и других функционально значимых элементов 63
1.5. Использование интеграционной карты локуса хромосомы человека 16q22.1 для выявления генов-супрессоров развития рака молочной железы
и других функциональных последовательностей 65
1.6. Интеграционная карта локуса q22.1 хромосомы человека как основа для выявления его доменной организации 66
2. Исследование доменной организации локуса хромосомы человека 16q22.1, содержащего LCAT генный кластер 67
2.1 Комбинирование метода ДНК-комет с флуоресцентной гибридизацией in situ в целях изучения петлевой организации хроматина 672.2. Изучение пространственной организации локуса хромосомы человека 16q22.1 с использованием комбинации флуоресцентной гибридизации in situ и метода ДНК-комет 69
2.3. Флуоресцентная гибридизация in situ с препаратами ядерного гало 75
2.4. Флуоресцентная гибридизация in situ проб из региона хромосомы человека 16q22.1 с препаратами человеческих хромосом 77
2.5. Флуоресцентная гибридизация in situ проб из региона хромосомы человека 16q22.1 с препаратами ядерного гало 79
2.6. Определение позиций индивидуальных последовательностей ДНК
внутри препаратов ядерного гало 79
Заключение 85
Выводы 87
Список литературы
