Введение
2. Обзор литературы. цитоплазматическая вакуолизация, вызванная ксенобиотиками и патогенами 8
2.1 Введение 8
2.2. Сопровождаемая вакуолизацией клеточная гибель под действием ксенобиотиков 9
2.2.1. Метуоз 9
2.2.2. Параптоз 11
2.2.3. Клеточное старение, некроптоз и онкоз 16
2.3. Вакуолизация при бактериальных инфекциях 17
2.3.1. Токсины структурного семейства АВ(5) 18
2.3.1.1. Токсины Stx2 и SubAB 18
2.3.1.2. Токсин CARDS 20
2.3.2. Пороформирующие токсины 21
2.4. Вакуолизация при вирусных инфекциях 25
2.4.1. Вирус лейкемии мышей 26
2.4.2. Вирус гепатита В человека 27
2.4.3. Вирус гепатита С человека и другие флавивирусы 28
2.4.4. Вирус обезьян SV40 29
2.4.5. Вирус папилломы человека 30
2.5. Заключение 31
3. Материалы и методы исследования 33
3.1. Реактивы и материалы 33
3.2. Клеточные линии, бактериальные штаммы, плазмиды и праймеры 33
3.3. Общие методы
3.3.1. Культивирование микроорганизмов и эукариотических клеток 33
3.3.2. Манипуляции с ДНК 3 5
3.3.3. Микроскопия 36
3.4. Определение экспрессии генов пробелокконвертаз, матриксных металлопротеаз и катепсинов В и D на уровне мРНК в опухолевых тканях лёгкого человека 37
3.5. Оценка цитотоксического действия генов исследуемых протеаз 40
3.5.1. Конструирование экспрессионных векторов
3.5.2. Получение моноклональных клеточных линий Tet-Off и Tet-Off Advanced 42
3.5.3. Оценка цитотоксического действия генов исследуемых протеаз на клетки линии НЕК293 Tet-Off 42
3.5.4. Характеристика цитотоксического действия гена ЗСрго на клетки линий А549 и Calu-1 Tet-Off Advanced 43
4. Результаты и обсуждение 46
4.1. Анализ экспрессии генов протеаз в тканях опухолей лёгкого человека 46
4.1.1. Экспрессия гена катепсина D снижена в опухолевых тканях лёгкого человека 46
4.1.2. Изменение экспрессии генов пробелокконвертаз при раке лёгкого человека происходит по ограниченному числу сценариев 50
4.2. Характеристика цитотоксических эффектов генов протеаз 57
4.2.1. Оценка цитотоксических эффектов при транзиентной экспрессии генов протеаз в клетках линии НЕК293 57
4.2.2. Характеристика цитотоксического действия протеазы ЗС вируса гепатита А человека 64
4.2.2.1. Экспрессия генов ЗСрго и ее каталитически неактивного варианта в раковых клетках 65
4.2.2.2. ЗСрго индуцирует каспазонезависимую гибель клеток 68
4.2.2.3. Вызываемые ЗСрго вакуоли формируются из компонентов эндосомалъно-лизосомалъного компартмента 71
4.2.2.4. Вызываемая ЗСрго вакуолизация не зависит от функционирования ГТФаз Rab5 и Rab7 76
4.2.2.5. Аутофагия не существенна для индуцированной ЗСрго вакуолизации и клеточной гибели 77
4.2.2.6. Индуцированные ЗСрго вакуоли не обладают характеристиками деградирующих органелл и не связаны с гиперактивацией макропиноцитоза 77
4.2.2.7. Роль ЗСрго в развитии цитопатического эффекта вируса гепатита А человека 80
4.2.2.8. Заключение 81
5. Выводы 82
6. Благодарности 83
7. Список сокращений 84
8. Список литературы
