Введение
1. Модифицированные протеиназы как катализаторы синтеза пептидов в органической среде 10
1.1. Механизм катализа пептидного синтеза протеиназами 10
1.1.1. Механизм катализа пептидного синтеза металлопротеиназами на примере термолизина 11
1.1.2. Механизм катализа пептидного синтеза сериновыми протеиназами 14
1.2. Влияние различных факторов на синтазную активность ферментов 15
1.3. Синтез пептидов, катализируемый модифицированными протеиназами 17
1.3.1. Синтез пептидов, катализируемый иммобилизованными протеиназами 17
1.3.1.1. Нековалентно иммобилизованные протеиназы в синтезе пептидов 18
1.3.1.2. Ковалентно иммобилизованные протеиназы в синтезе пептидов 27
1.3.1.3. Протеиназы, модифицированные альтернативными способами, как катализаторы пептидного синтеза в органической среде 36
1.3.2. Влияние содероісания воды вреащионной среде на эффективность проведения пептидного синтеза, катализируемого модифицированными протеиназами 42
1.3.3. Субстратная специфичность нативных и модифицированных протеиназ в пептидном синтезе в органической среде 45
1.3.3.1. Субстратная специфичность металлопротеиназ в реакциях пептидного синтеза на примере термолизина 46
1.3.3.2. Субстратная специфичность сериновых протеиназ в реакциях пептидного синтеза в органической среде 48
2. Обсуждение результатов 52
2.1. Получение и характеристика биокатализаторов на основе протеиназ, иммобилизованных на криогеле поливинилового спирта 52
2.1.1. Выбор протеиназ для иммобилизации 52
2.1.2. Получение носителей для иммобилизованных ферментов, базирующихся на криогелях поливинилового спирта 53
2.1.3. Иммобилизация протеиназ на криогеле поливинилового спирта 56
2.1.3.1. Иммобилизация трипсина на криогеле поливинилового спирта 57
2.1.3.2. Иммобилизация субтилизина, термолизина и химотрипсина на криогеле поливинилового спирта 64
2.2. Использование иммобилизованных ферментов в ферментативном пептидном синтезе 68
2.2.1. Использование иммобилизованного трипсина в ферментативном пептидном синтезе 69
2.2.2. Использование иммобилизованного субтилизина в ферментативном пептидном синтезе 71
2.2.3. Использование иммобилизованного термолизина в ферментативном пептидном синтезе 86
2.2.4. Синтез хромогенных и флуорогенных субстратов протеиназ под действием иммобилизованных ферментов 94
3. Экспериментальная часть 105
3.1. Иммобилизация протеиназ на криоПВСГ 107
3.1.1. Активация криогеля ПВС дшинилсульфоном 107
3.1.2. Активация криогеля ЛВС глутаровым альдегидом 107
3.1.3. Иммобилизация трипсина на активированном носителе 107
3.2. Изучение ферментативных свойств иммобилизованных ферментов в водных растворах 108
3.2.1. Определение гидролитической активности иммобилизованного трипсина 108
3.2.2. Изучение стабильности иммобилизованного трипсина в водном буфере 108
3.2.3. Определение активности иммобилизованного субтилизина 109
3.2.4. Изучение стабильности иммобилизованного субтилизина в водном буфере 109
3.2.5. Измерение ферментативной активности термолизина по гидролизу Dnp-Gly-Gly-Ile-Arg 110
3.2.6. Изучение стабильности иммобилизованного термолизина в водном буфере 110
3.2.7. Изучение стабильности иммобилизованного термолизина в смесях органических растворителей 111
3.2.8. Определение активности иммобилизованного химотрипсина 111
3.3. Изучение иммобилизованных ферментов в синтезе пептидов 112
3.3.1. Синтезы, катализируемые иммобилизованным трипсином 112
3.3.1.1. Синтез Z-Phe-Arg-Leu-pNA 112
3.3.1.2. Синтез Z-Ala-Ala-Arg-Phe-pNA 112
3.3.2. Синтезы, катализируемые иммобилизованным субтилизином 113
3.3.2.1. Зависимость скорости синтеза от концентрации субстратов 113
3.3.2.2. Синтез Z-Ala-Ala-Leu-Phe-pNA (модельнаяреакция) 113
3.3.2.3. Изучение зависимости синтеза Z-Ala-Ala-Leu-Phe-pNA от содержания ДМФ. 114
3.3.2.4. Конденсация Z-Ala-Ala-Leu-OMe (Z-Ala-Ala-Leu-OH) и Phe-pNA 114
3.3.2.5. Синтез Z-Leu-Phe-pNA и Z-Ala-Leu-Phe-pNA 114
3.3.2.6. Синтез Boc-Leu-Phe-pNA 115
3.3.2.7. Синтез Z-Ala-Ala-Leu-pNA 115
3.3.2.8. Синтез Z-Ala-Ala-Arg-Phe-pNA 116
3.3.2.9. Синтез Z-Ala-Ala-Arg-Glu-pNA 116
3.3.2.10. Препаративный синтез Z-Ala-Ala-Leu-pNA 116
3.3.2.11. Синтез Z-Thr-Ala-Thr-Asp-pNA 117
3.3.3. Синтезы, катализируемые иммобилизованным термолизином 117
3.3.3.1. Синтез Z-Ala-Ala-Leu-pNA в смеси 25% ацетонитрил/75% ДМФ 117
3.3.3.2. Изучение влияния концентрации иммобилизованного термолизина на эффективность синтеза Z-Ala-Ala-Leu-pNA 118
3.3.3.3. Изучение зависимости эффективности синтеза Z-Ala-Ala- Leu-pNA от концентрации исходных компонентов 118
3.3.3.4. Изучение зависимости эффективности синтеза Z-Ala-Ala-Leu- pNA от содержания ДМФ 118
3.3.3.5. Изучение зависимости эффективности синтеза Z-Ala-Ala-Leu- pNA от содержания воды в реакционной смеси 119
3.3.3.6. Изучение зависимости эффективности синтеза Z-Ala-Ala-Leu- pNA от содержания ДМСО 119
3.3.3.7. Синтез Z-Ala-Ala-Leu-pNA, катализируемый одним образцом иммобилизованного термолизина, в смеси 70% ацетонитрил/20% ДМФ/10% вода 119
3.3.3.8. Конденсация Z-Ala-Ala-OH и Phe-pNA 119
3.3.3.9. Препаративный синтез Z-Ala-Ala-Leu-pNA 120
3.3.3.10. Конденсация Z-Asp-OH и Phe-OMe 121
3.3.4. Синтезы, катализируемые иммобилизованным химотрипсином 121
3.3.4.1. Синтез Glp-Phe-Ala-AMC 121
3.3.4.2. Изучение возмооїсности повторного использования иммобилизованного химотрипсина в синтезе Glp-Phe-Ala-AMC 122
3.3.4.3. Препаративный синтез Glp-Phe-Ala-AMC 122
Выводы 123
