Введение
2. Литературный обзор
2.1. Протеолитические ферменты - общая характеристика . 8
2.2. Протеолитические ферменты растений. 12
2.3. Протеазы семян растений. 14
2.4. Протеазы семян бобовых. 18
2.5. Протеолитические ферменты соевых бобов. 26
2.6. Белковые ингибиторы протеаз в растениях. 30
2.7. Белковые ингибиторы семян растений как регуляторы активности собственных протеаз 35
3. Материалы и методы исследования
3.1. Характеристика объекта исследования 42
3.2. Обезжиривание измельченного материала 42
3.3. Проращивание семян сои 43
3.4. Определение белка по методу Лоури 43
3.5. Определение активности протеаз по методу Ансона 43
3.6. Определение начальной скорости реакции, протеолиза сывороточного альбумина 45
3.7. Выделение .протеаз сои
3.7.1. Выбор.экстрагента для извлечения, протеаз сои 47
3.7.2. Выбор оптимального времени извлечения ферментов 47
3.8. Лиофилизация препаратов протеаз и белковых ингибиторов . 47
3.9. Гель-хроматография препаратов протеаз и ингибиторов 50
3.10. Ионообменная хроматография. 50
3.11. Изоэлектрическое .фокусирование 51
3.12. Аффинная хроматография 52
3.13. Электрофорез в ПААГ 53
3.14. Получение зимограмм протеаз после диск-электрофореза в ПААГ 54
4. Характеристика протеолитйчкскйх ферментов сой
4.1. Определение оптимума рН действия протеаз 55
4.2. Осаждение протеаз сои при изменении рН 58
4.3. Стабильность протеаз при хранении измельченного материала и препаратов ферментов 63
4.4. Влияние температуры на активность протеаз сои 69
4.5. Влияние активаторов и ингибиторов на протеазы сои 71
4.5.1. Влияние активаторов и ингибиторов тиоловых протеаз 71
4.5.2. Влияние ингибиторов сериновых протеаз 73
4.5.3. Влияние ЭДТА на активность протеаз сои 76
4.5.4. Влияние"триптофана и тирозина на активность протеаз 78
4.5.5. Влияние Nace на активность протеаз 80
5. Очистка протеаз сои
5.1. Выделение и очистка нейтральных протеаз сои 83
5.1.1. Фракционирование протеаз сульфатом аммония 83
5.1.2. Осаждение нейтральных протеаз при подкислении 85
5.1.3. Ионообменная хроматография нейтральных протеаз 85
5.1.4. Схема очистки нейтральных протеаз 87
5.2. Выделение и очистка щелочных протеаз сои 89
5.2.1. Осаждение щелочных протеаз при подкислении 89
5.2.2. Ионообменная хроматография щелочных протеаз , 89
5.2.3. Аффинная хроматография щелочной протеазы I 95
5.2.4. Схема очистки щелочных протеаз сои 99
6. Характеристика очищенных препаратов протеаз сои
6.1. Характеристика очищенного препарата нейтральных протеаз 102
6.1.1. Определение оптимума рН 102
6.1.2. Влияние активаторов и ингибиторов 102
6.1.3. Определение молекулярной массы 104
6.1.4. Определение однородности препаратов нейтральных протеаз методом электрофореза в ПААГ 105
6.2. Характеристика очищенного препарата щелочных протеаз сои 108
6.2.1. Определение оптимума рН 108
6.2.2. Влияние активаторов и ингибиторов 108
6.2.3. Определение молекулярной массы. НО
6.2.4. Определение однородности препаратов щелочных протеаз методом электрофореза в ПААГ 112
6.2.5. Определение изоэлектрической точки щелочной протеазы 112
7. Белковые протеаз сои и их взаимодействие с ферментами сои .
7.1. Взаимодействие протеаз сои с ингибиторами надосадочной жидкости 118
7.2. Выделение белковых ингибиторов из надосадочной жидкости 122
7.3. Гель-фильтрация препарата белковых ингибиторов на сефадексе в -75 124
7.4. Электрофорез в ПААГ препаратов белковых ингибиторов 128
7.5. Изоэлектрическое фокусирование препарата ингибиторов 128
7.6. Схема выделения препаратов ингибиторов 130
7.7. Аффинная хроматография протеаз сои на иммобилизованных белковых ингибиторах 133
8. Действие протеаз сои на собственные белки . 140
9. Изменение активности протеаз и их ингибиторов при прорастании семян сои. 143
10. Выводы. 149
11. Список литературы, 151
