Введение
1 Введение 9
1.1 Актуальность проблемы, цель и задачи работы 9
1.2 Научная новизна и практическая значимость работы 13
1.3 Структура изложения материала 15
2 Обзор литературы 17
2.1 Общая характеристика проблемы 17
2.2 Методы масс-спектрометрического профилирования плазмы крови 19
2.2.1 Получение и обработка биологических образцов 19
2.2.2 Метод SELDIOF для профилирования плазмы крови 21
2.2.3 MALDIOF-профилирование сыворотки/плазмы посредством хроматографического разделения на микрогранулах 23
2.2.4 Методы, используемые для удаления из сыворотки или плазмы высококопийных белков 25
2.2.5 Белки и пептиды, ассоциированные с белками-носителями 27
2.2.6 Анализ активности экзопротеаз 29
2.2.7 Масс-спектрометрический анализ, совмещенный с иммунным подходом: исследование профилей модификации белков 31
2.2.8 Масс-спектрометрический анализ сывороток, расщепленных трипсином
2.3 Полноразмерные белки, идентифицированные при помощи maldiof-macc-спектрометрии как потенциальные биомаркеры злокачественных опухолей 39
2.3.1 Аполипопротеины 40
2.3.2 Фрагменты комплемента 41
2.3.3 Гаптоглобин 42
2.3.4 Сывороточный амилоид А острой фазы 43
2.3.5 Альфа-1-антитрипсин 44
2.3.6 Транстиретин 45
2.3.7 Трансферрин 47
2.3.8ЦистатинС 53
2.4 Пептидные фрагменты и их происхождение 54
2.5 Перспективы подходов протеомного штрих-кода 55
3 Материалы и методы 5 8
3.1 Методы исследования термостабильной фракции сывороток посредством двумерного электрофореза 5 8
3.1.1 Пациенты 58
3.1.2 Получение термостабильной фракции сыворотки 5 8
3.1.3 Подготовка проб и двумерный электрофорез 59
3.1.4 Анализ изображения гелей 60
3.1.5 Идентификация белков с помощью MALDIOF(OF) MS
3.2 Методы идентификации сывороточного амилоида а как компонента протеомного штрих-кода рака яичника 63
3.2.1 Пациенты 63
3.2.2 Термостабильная фракция плазмы крови 63
3.2.3 Масс-спектрометрия SELDIOF MS 63
3.2.4 Модификация остатков цистеина белков 4-винилпиридином 64
3.2.5 MALDIOF MS 65
3.2.6 2Б-Электрофорез для исследования форм сывороточного амилоида А 66
3.2.7 Разделение белков термостабильной фракции плазмы путем ВЭЖХ 68
3.3 Методы анализа протеомного штрих-кода для диагностики рака яичника 69
3.3.1 Пациенты 69
3.3.2 Иммуноферментный анализ 69
3.3.3 Профилирование сывороток с применением SELDIOF 71
3.3.4 Анализ масс-спектров 73
3.3.5 Статистическая обработка результатов 74
3.4 Методы анализа протеомного штрих-кода для диагностики рака предстательной железы 78
3.4.1 Пациенты 78
3.4.2 Получение плазмы крови 78
3.4.3 Выбор метода проведения протеомного исследования образцов плазмы крови
3.4.4 Статистическая обработка результатов протеомного штрих-кода и разработка диагностического метода 81
3.5 Методы анализа масс-спектрометрических и цитокиновых профилей сыворотки крови для диагностики т-клеточной лимфомы кожи 83
3.5.1 Пациенты 83
3.5.2 Сбор крови и получение сыворотки 84
3.5.3 MALDIOF-масс-спектрометрия 85
3.5.4 Иммунофлуоресцентный анализ цитокинов хМАР 86
3.5.5 Статистический анализ результатов 86
4 Результаты и их обсуждение 89
4.1 Пилотное исследование термостабильной фракции сывороток пациентов с различными злокачественными опухолями, характерными для женщин, методом двумерного электрофореза 89
4.1.1 Термостабильная фракция сыворотки 90
4.1.2. Дифференциально экспрессирующиеся белки, выявленные методом
двумерного электрофореза в сыворотках пациентов с различными
злокачественными опухолями, характерными для женщин 92
4.2 Сывороточный амилоид а в составе масс спектрометрического протеомного штрих-кода при раке яичника 100
4.2.1 Исследование термостабильной фракции плазмы крови посредством масс спектрометрии SELDIOF 100
4.2.2 Дифференциальный пик протеомного штрих-кода рака яичника с m/z 11,7 кДа
102
4.2.3 Идентификация пиков с m/z 11,5/11,7 кДа 102
4.2.4 Сравнение данных SELDIOF-масс-спектрометрии и карт 20-электрофореза в контексте молекул сывороточного амилоида А 108
4.2.5 Выделение продукта с молекулярной массой 11,7 кДа посредством жидкостной хроматографии и его прямая идентификация 112
4.3 Протеомныи штрих-код сыворотки крови для диагностики рака яичника 116
4.3.1. Определение концентрации белка A-SAA в сыворотках методом иммуноферментного анализа 116
4.3.2 Масс-спектрометрическая детекция белка A-SAA в сыворотке крови 119
4.3.3 Обработка масс-спектров спектров SELDIOF, полученных с использованием чипов с нормальнофазовой поверхностью, с использованием жестких критериев для идентификации пиков 128
4.3.4 Классификация масс-спектров SELDIOF с использованием метода пар с наибольшим счетом (TSP) 129
4.3.5 Разработка диагностического алгоритма на основе комбинированных протеомных данных с использованием метода опорных векторов и логистической регрессии 132
4.3.6 Анализ результатов перекрестной проверки достоверности 133
4.3.7 Кластерный анализ данных масс-спектров SELDIOF 136
4.3.8 Дискриминаторные пики SELDIOF, характерные для рака яичника и отобранные различными классификаторами 148
4.3.9 Почему раковые клетки продуцируют белок острой фазы сывороточный амилоид А 152
4.4 Протеомный штрих-код плазмы крови для диагностики рака предстательной железы 160
4.4.1 Оптимизация условий получения масс-спектрометрических штрих-кодов плазмы крови методами хроматографических белковых чипов SELDI, магнитных гранул ClinProt WCX и хроматографических наконечников ZipTip С18 161
4.4.2 Разработка диагностического алгоритма на основе масс-спектров MALDIOF после фракционирования на ZipTip С18 168
4.5 Масс-спектрометрические и цитокиновые профили сыворотки крови для диагностики т-клеточной лимфомы кожи 173
4.5.1 Масс-спектрометрический штрих-код сыворотки при Т-клеточной лимфоме кожи, полученный путем MALDIOF-масс-спектрометрии 176
4.5.2 Профилирование цитокинов сыворотки при Т-клеточной лимфоме кожи с использованием технологии хМАР 182
4.5.3 Итоги протеомного профилирования для диагностики Т-клеточной лимфомы кожи 185
4.6 Мультиплексный протеомныи анализ для диагностики злокачественных опухолей: настоящее и перспективы 187
4.6.1 Технические перспективы протеомного штрих-кода 187
4.6.2 Проблемы введения мультиплексных тестов в клиническую практику 191
4.6.3 Протеомныи штрих-код в контексте проекта «Протеом человека» 194
5 ВЫВОДЫ 197
Список сокращений 199
Список работ, опубликованных по теме диссертации 201
Список цитируемой литературы
