Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Общее содержание и подвижность ионов меди и цинка во внутриклеточной среде .11
1.2. Лабильный пул меди и цинка как необходимый элемент системы распределения этих металлов в клетке .14
1.3. Возможные лиганды лабильной меди в клетке 17
1.4. Возможные лиганды лабильного цинка в клетке 23
1.5. Влияние термодинамической устойчивости комплексов на реакционную способность лабильных форм меди и цинка 25
1.6. Токсическое действие меди и цинка объясняется нарушением равновесия между этими металлами и их внутриклеточными лигандами .30
1.7. Роль неизбирательно связанных ионов меди в развитии окислительного стресса 1.8. Механизмы повреждающего действия ионов меди и цинка на биологические мембраны 35
1.9. Стратегия и механизмы защиты растений от токсического действия избытка меди в среде 1.9.1. Металлотионеины .38
1.9.2. Фитохелатины 39
1.9.3. АВС-транспортеры 40
1.9.4. Металлошапероны и белки HIP 41
1.9.5. Белки NRAMP 42
1.9.6. Белки YSL .43
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1. Условия выращивания растений и проведения опытов 45
2.2. Физиологические методы исследований .46
2.2.1 Определение содержания воды в тканях растений .46
2.2.2. Определение содержания меди и цинка в тканях растений 46
2.2.3 Определение содержания фотосинтетических пигментов в листьях растений 47
2.2.4. Определение максимального квантового выхода фотохимических
реакций фотосистемы II 47
2.2.5. Определение содержания общего и окисленного глутатиона в корне 47
2.2.6 Статистическая обработка результатов 48
2.3. Методы молекулярно-биологического анализа 48
2.3.1. Подбор праймеров к исследованным генам .48
2.3.2. Выделение тотальной РНК 49
2.3.3. Определение количества и качества нуклеиновых кислот 50
2.3.4. Очистка образцов РНК от примеси геномной ДНК 50
2.3.5. Обратная транскрипция 51
2.3.6. Полимеразная цепная реакция 51
2.3.7. Электрофорез в агарозном геле .51
2.3.8. Статистическая обработка результатов 52
2.4. Микроскопические исследования 52
2.4.1. Оценка степени повреждения мембран клеток корня .52
2.4.2. Оценка накопления супероксид-радикала в корне 52
2.4.3. Оценка изменения содержания в корне лабильных форм меди 53
2.4.4. Оценка изменения содержания в корне лабильных форм цинка .54
2.4.5. Оценка уровня перекисного окисления липидов в корне 54
2.4.6. Оценка содержания в корне восстановленного глутатиона .55 Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ 56 3.1. Влияние избытка меди на некоторые физиологические параметры растения рапса 3.1.1. Содержание меди в корнях и листьях .56
3.1.2. Оводненность листьев 58
3.1.3. Содержание фотосинтетических пигментов и максимальный квантовый выход фотосистемы II .58
3.2. Влияние избытка меди в среде на экспрессию некоторых генов, связанных с детоксикацией тяжелых металлов в растениях рапса 59
3.2.1. Экспрессия генов металлотионеинов .60
3.2.2. Экспрессия гена PCS1 .62
3.2.3. Экспрессия генов MRP 62
3.2.4. Экспрессия генов HIP 63
3.2.5. Экспрессия гена CCS 64
3.2.6. Экспрессия гена ZIP5 .64
3.2.7. Экспрессия гена YSL2 64
3.2.8. Экспрессия гена NRAMP4
3.3. Морфологические изменения корневой системы рапса под влиянием различных концентраций меди и цинка 66
3.4. Нарушение целостности плазмалеммы при действии ионов меди и цинка .67
3.5. Изменение содержания лабильных форм меди и цинка в тканях корня при избыточном содержании этих металлов в среде .69
3.6. Дифференцированное определение содержания цинка в разных зонах корня 73
3.7. Влияние избытка меди и цинка на содержание восстановленного глутатиона в клетках корня .74
3.8. Влияние избытка меди и цинка на содержание общего и окисленного глутатиона в корне 77
3.9. Влияние избытка меди и цинка на развитие перекисного окисления липидов мембран 81
3.10. Влияние ионов меди и цинка на генерацию супероксид-радикала в корне 85
Глава 4. Обсуждение 88
4.1. Влияние избытка меди на некоторые физиологические процессы в растениях рапса 88
4.2. Связь между накоплением меди в корнях и уровнем экспрессии генов детоксикации ее избытка .89
4.3. Влияние избыточных концентраций меди и цинка на морфологию корней рапса 92
4.4. Повреждающее действие избытка меди и цинка на плазмалемму клеток корня .93
4.5. Изменение содержания лабильных форм меди и цинка в клетках корня при избытке металлов в среде 94
4.6. Возможная роль глутатиона в связывании избытка меди и цинка в клетках корня рапса .96
4.7. Роль перекисного окисления липидов в нарушении целостности мембран 98
Заключение 102
Выводы 104
Список литературы
