Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1 Заболеваемость раком желудка, проблемы диагностики 12
1.2 Белковые маркеры рака желудка 12
1.3 Молекулярно-генетические маркеры рака желудка 15
1.3.1 Генетические изменения 16
1.3.2 Эпигенетические изменения 21
1.4 Циркулирующие ДНК 27
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 30
2.1 Материалы 30
2.1.1 Клинические характеристики здоровых доноров и больных раком желудка 30
2.1.2 Реактивы и препараты 32
2.1.3 Оборудование 33
2.2 Методы 33
2.2.1 Взятие образцов крови 33
2.2.2 Приготовление элюатов с поверхности форменных элементов крови 34
2.2.3 Определение концентрации циркулирующих ДНК в крови 34
2.2.3.1 Метод сорбции циркулирующих ДНК на модифицированном стекле 34
2.2.3.2 Линии клеток и методы культивирования 35
2.2.3.3 Приготовление раствора ДНК с целью построения калибровочной кривой... 35
2.2.3.4 Определение концентрации циркулирующих ДНК в плазме и элюатах, выделенных с клеточной поверхности форменных элементов клеток крови 36
2.2.4 Определение статуса метилирования промоторных областей генов опухолевой супрессии MGMT, р15 и hMLHl в цирДНК 37
2.2.4.1. Выделение циркулирующих ДНК из плазмы и элюатов с клеточной поверхности 37
2.2.4.2 Бисульфитная модификация ДНК 37
2.2.4.3. Получение геномной ДНК для положительного и отрицательного контроля в мет-ПЦР 38
2.2.4.4. Полимеразная цепная реакция, специфичная к метилированию 38
2.2.4.5. Визуализация продуктов мет-ПЦР 41
2.2.5. Иммунохимический анализ маркеров РЭА, СА 19.9 и СА 72.4 в плазме крови больных раком желудка и здоровых людей 41
2.3. Статистическая обработка данных . 41
ГЛАВА 3. Собственные результаты 43
3.1 Исследование концентраций циркулирующих ДНК 43
3.1.1. Приготовление растворов ДНК для построения калибровочных кривых 43
3.1.2 Концентрация цирДНК плазмы и связанных с поверхностью форменных элементов в крови здоровых доноров 43
3.1.3 Особенности циркуляции внеклеточных ДНК в крови больных раком желудка 46
3.2 Анализ статуса метилирования промоторных областей генов mmm опухолевой супрессии р15, MGMT, hMLHl в циркулирующих ДНК плазмы и связанных с поверхностью форменных элементов в крови клинически здоровых людей и больных раком желудка 54
3.2.1. Контроль на наличие ДНК в вьщеленных образцах ДНК плазмы и связанных с клеточной поверхностью 54
3.2.2. Исследование профиля метилирования промоторной области гена р15 55
3.2.3. Исследование профиля метилирования промоторной области гена hMLHl 56
3.2.4 Исследование профиля метилирования промоторной области гена MGMT 57
3.3. Сравнительное исследование чувствительности и специфичности анализов эпигенетических маркеров (р15, MGMT, hMLHl) в цирДНК и стандартных онкоспецифических белков (РЭА, СА 19.9, СА 72.4) при раке желудка 62
3.3.1 Иммунохимический анализ онкомаркеров РЭА, СА 19.9, СА 72.4 62
3.3.2. Сравнительный анализ методов основанных на определении белковых маркеров и статуса метилирования генов опухолевой супрессии 64
Заключение 68
Выводы 81
Практические рекомендации 82
Список литературы 83
