Введение
Глава 1. Вирус гриппа, как мишень для действия антисмысловых олигонуклеотидов (обзор литературы) 9
1.1. Разнообразие ортомиксовирусов 10
1.2. Биологические свойства вируса гриппа 11
1.2.1. Структура вириона вируса гриппа 11
1.3. Структура генома, кодируемые белки и их функции 12
1.3.1. Организация генома вируса гриппа 12
1.3.2. Белки полимеразного комплекса и их гены 14
1.3.3. Белок нуклеокапсида и кодирующий его ген 16
1.3.4. Геммаглютинин и его ген 17
1.3.5. Гидролитическая активация НА и ее связь с патогенностью вирусов гриппа 19
1.3.6. Нейраминидаза и кодирующий ген 20
1.3.7. 7-ой сегмент геномной РНК вируса гриппа: структура и кодируемые белки 22
1.3.7.1. М1-белок матрикса 23
1.3.7.2. Строение и функция белка М2 28
1.3.8. 8-ой сегмент геномной РНК вируса гриппа: структура и кодируемые белки 28
1.3.8.1. Белок NS1 28
1.3.8.2. Белок NS2 29
1.4. Жизненный цикл вируса гриппа 29
1.4.1. Адсорбция вируса, проникновение в клетку и распаковка вирусной частицы 29
1.4.2. Особенности репродукции вируса гриппа 31
1.4.2.1. Синтез вирусных мРНК 33
1.4.2.2. Репликация вирионной РНК 35
1.4.3. Регуляция экспрессии вирусных белков в инфицированных клетках 36
1.4.4. Внутриклеточный транспорт вирусных белков, сборка вириона и почкование 37
1.4.4.1. Ядерно-цитоплазматический транспорт вирусных белков 37
1.4.4.2. Внутриклеточный транспорт интегральных белков вириона 37
1.4.4.3. Функциональная роль белка NS1 в регуляции экспрессии вирусных и клеточных генов 38
1.4.4.4. Регуляция уровня сплайсинга мРНК NS1 и М2 40
1.4.4.5. Влияние вируса гриппа на экспрессию клеточных белков 40
1.4.4.6. Сборка геномных сегментов и формирование вирионов 41
1.5. Применение антисмысловых олигонуклеотидов для подавления репродукции вируса гриппа 45
1.5.1. Антисмысловые олигонуклеотиды в качестве антивирусных препаратов 45
1.5.2. Использование рибозимов для подавления развития вируса гриппа 54
Глава 2. Экспериментальная часть 58
2.1. Материалы 58
2.1.1. Реактивы и препараты 58
2.1.2. Плазмиды 59
2.1.3. Олигонуклеотиды 59
2.1.4. Буферные растворы, использованные в работе 59
2.2. Методы 61
2.2.1. Рестрикционный анализ плазмидных ДНК 61
2.2.2. Клонирование М2 РНК вируса гриппа 61
2.2.3. Получение РНК с помощью транскрипции in vitro 62
2.2.4. Получение радиоактивномеченых препаратов РНК и олигонуклеотидов 63
2.2.5. Изучение вторичной структуры М2 РНК вируса гриппа методом пробинга 64
2.2.6. Расщепление РНК искусственными рибонуклеазами 65
2.2.7. Синтез коньюгатов олигонуклеотидов и имидазолсодержащих конструкций 67
2.2.8. Сайт-направленное расщепление РНК с помощью коньюгатов олигонуклеотидов 67
2.2.9. Ингибирование сайт-направленного расщепления TPHKPhe конъюгатом 2В- R 67
2.2.10. Молекулярное моделирование 68
2.2.11. Гель-злектрофорез 68
Глава 3. Химические рибонуклеазы - коньюгаты 1.4 - диазабицикло[2.2.2]октана и имидазола, как зонды для исследования структуры РНК в растворе (Результаты и обсуждение) 69
3.1. Дизайн химических рибонуклеаз 69
3.2. РНК модели 70
3.3. Схема эксперимента 71
3.4. Расщепление РНК под действием искусственных рибонуклеаз 71
3.4.1. Специфичность расщепления РНК соединениями ABL3Cm ...71
3.4.2. Влияние вторичной структуры РНК на специфичность и эффективность расщепления 77
3.4.3. Влияние концентрации соединений ABL3Cm на скорость расщепления РНК 79
3.4.4. Кинетика расщепления РНК соединениями ABL3Cm ^..83
3.4.5. Эффективность расщепления РНК искусственными рибонуклеазами 91
3.4.6. Доказательство каталитического характера расщепления фосфодиэфирных связей в РНК под действием ABL3Cm 92
3.4.7. Доказательство того, что расщепление РНК происходит под действием искусственных рибонуклеаз 93
3.5. Влияние условий проведения реакции на процесс расщепления РНК искусственными РНКазами 94
3.5.1. Влияние природы буфера на расщепление РНК соединениями ABL3Cm 94
3.5.2. Влияние рН на скорость расщепления РНК соединениями ABL3Cm „..98
3.5.3. Влияние температуры на эффективность расщепления фосфодиэфирных связей
в РНК соединениями ABL3Cm 98
3.6. Механизм расщепления РНК под действием химических рибонуклеаз 100
3.7. Применение искусственных рибонуклеаз для исследования пространственной
структуры РНК в растворе 103
3.7.1. Пробинг вторичной структуры in vitro транскриптов митохондриальных TPHKLys, дикого типа (Kwt) и содержащего замену (А9->С) (Krw) 103
3.7.2. Пробинг вторичной структуры М2 РНК вируса гриппа 108
Глава 4. Направленное расщепление РНК коньюгатами антисмысловых олигонуклеотидов с имидазолсодержащими конструкциями 116
4.1. Синтез коньюгатов олигонуклеотидов путем пост-синтетической модификации и выбор РНК мишени 117
4.2. Направленное расщепление дрожжевой TPHKPhe коньюгатами с моно- и бисимидазолсодержащими конструкциями 118
4.2.1. Специфичность и эффективность расщепления тРНКРЫг коньюгами олигонуклеотидов, несущих моно- и бисимидазолсодержащие конструкции 118
4.2.2. Кинетические и концентрационные закономерности расщепления РНК коньюгатом
2B-R2 124
4.2.3. Влияние природы буфера на скорость направленного расщепления РНК 125
4.2.4. Доказательство протекания расщепления РНК в составе комплементарного комплекса 125
4.2.5. Расщепление высокомолекулярных РНК коньюгатами олигонуклеотидов и имидазолсодержащих конструкций 126
4.3. Сайт-направленное расщепление РНК с помощью коньюгатов олигонуклеотидов, несущих имидазолсодержащие дендримерные конструкции 128
4.3.1. Дизайн коньюгатов олигонуклеотидов, содержащих от 2-х до 32-х остатков имидазола 128
4.3.2. Постановка эксперимента 129
4.3.3. Исследование сайт-направленного расщепления TPHKPhe коньюгатами олигонуклеотидов с дендримерными имидазолсодержащими химическими конструкциями 130
4.3.4 Ингибирование сайт-направленного расщепления тРНКРЬе коньюгатами 137
4.3.5. Расщепление TPHKPhe коньюгатами, несущими бисимидазолсодердащие конструкции 2B-dl2(m) 136
4.3.6. Направленное расщепление тРНКРЬе коньюгатами, несущими тетраимидазолсодердащие конструкции 2B-dl4(m) 139
4.3.7. Направленное расщепление TPHKPhe коньюгатами, несущими от 8-й до 32-х остатков имидазола в составе гидролизующей конструкции 142
4.3.8. Влияющие условий проведения реакции и структуры коньюгатов 2B-dlk(m) на эффективность направленного расщепления TPHKPhe 143
4.3.9. Молекулярное моделирование искусственных РНКаз 147
Выводы 158
Список литературы 159
