Введение
Глава 1. Роль неферментативного гликозилирования протеинов в патогенезе сахарного диабета 12
1,1 .Распространенность и социальная значимость сахарного диабета..12
1.2. Сосудистые осложнения и диагностические критерии сахарного диабета 13
1.3. Гликозилированный гемоглобин, его структура 17
1.4. Биохимия неферментативного гликозилирования протеинов 19
1.5. Роль гликозилированных протеинов в патогенезе сахарного диабета 21
1.6. Взаимосвязь между нарушениями углеводного обмена и онкологическими заболеваниями 23
1.7. Диагностическое значение определения уровня Hb Aic 27
1.8. Методы ранней диагностики нарушений углеводного обмена 27
1.9. Сравнительный анализ методов определения уровня НЬ А!С 28
Глава 2. Аффинный метод выделения биополимеров 33
2.1. Принцип аффинной хроматографии 35
2.2. Компоненты аффинного сорбента 36
2.3. Материалы, применяемые в качестве матрицы аффинного сорбента 37
2.3.1. Агароза 38
2.3.2. Поливиниловый спирт 40
2.3.3. Макропористое стекло 40
2.3.4. Полиакриламидный гель 41
2.4. Активация матрицы аффинного сорбента 42
2.5. Спейсеры 43
2.6. Лиганды 44
2.7. Аффинная модификация биополимеров 45
Глава 3. Материалы и методы исследования 49
3.1. Реагенты для синтеза аффинного сорбента с иммобилизованной м-АФБК 49
3.2. Реагенты для проведения цветных реакций 51
3.3. Реагенты для приготовления буферных растворов 51
3.4. Объекты исследования на аффинных сорбентах 51
3.5.Приборы, необходимые для работы 52
3.6. Определение рН растворов стеклянным электродом 52
3.7. Определение оптической плотности растворов 52
3.8. Определение альдегидных групп реактивом Шиффа 53
3.9. Определение альдегидных групп реактивом Несслера 53
3.10. Цветная реакция с ТНБС натрия 53
3.11. Определение оксирановых групп тиосульфатом натрия 54
3.12. Определение карбоксильных, гидразидных и аминных групп
кислотно-основным титрованием 54
3.13. Статистическая обработка результатов 55
Глава 4. Создание аффинных сорбентов с иммобилизованной лг-АФБК для количественного определения гликозилированного гемоглобина 56
4.1. Аффинный сорбент с иммобилизованной ,«-АФБК на основе гранулированной агарозы 57
4.1.1. Приготовление матрицы аффинного сорбента эпоксиактивацией гранулированной агарозы 58
4.1.2. Иммобилизация м-АФБК на модифицированную агарозную матрицу сорбента 58
4.2. Аффинный сорбент с иммобилизованной лг-АФБК на основе модифицированного ПААГ 59
4.2.1. Синтез широкопористого ПААГ в качестве матрицы аффинного сорбента 59
4.2.2. Модифицирование ПААГ гидразингидратом 60
4.2.3. Активация глутаровым алвдегидом гидразидного производного полиакриламидного геля 61
4.2.4. Иммобилизация л4.2.5. Стабилизация азометимовых связей в аффинном сорбенте с иммобилизованной .«-АФБК 63
4.3. Аффинное выделение гликогемоглобина 65
4.4. Хроматограмма выделения гликозилированного гемоглобина 65
4.5. Формула расчета содержания НЬА|С 66
4.6. Механизм аффинного взаимодействия сорбентов с иммобилизованной.и-АФБК с гликозилированным гемоглобином 66
4.7. Исследование количественной характеристики параметров синтеза аффинного сорбента с иммобилизованной м- АФБК на основе
4.7.1. Исследование влияния бис-метиленакриламида на свойства полиакриламидного геля 68
4.7.2. Исследование зависимости изменения емкости сорбента от содержания бора в лиганде 69
4.7.3. Исследование зависимости соотношений между количеством связавшегося лиганда и концентрацией исходного раствора 70
4.7.4. Определение рН-оптимума буферной системы при иммобилизации л-/-АФБК 71
4.8. Исследование влияния температуры на сорбционнуго активность аффинного сорбента на основе ПААГ 72
4.9. Исследование изменения емкости сорбента от объема нагрузки .74
4.10. Исследование емкости сорбента при нагрузке гликогемоглобином от изменения рН буфера 75
4.1.1. Воспроизводимость результатов определения HbAic при многократном использовании одной колонки с аффинным сорбентом на основе ПААГ с иммобилизованной м- АФБК 75
4.1.2. Вариабельность показателей определения HbAic, многократно проведенных на одной колонке с аффинным сорбентом на основе ПААГ . 76
4.13. Исследование воспроизводимости результатов определения HbAic, полученных при многократном использовании одной колонки с аффинным сорбентом на основе агарозы 77
4.14. Оценка эффективности применения аффинного сорбента на основе макропористого стекла 79
Глава 5. Разработка методики количественного определения гликозилированного гемоглобина аффинной тест-системой 80
5.1. Техника безопасности при проведении работ по определению гликозилированного гемоглобина 80
5.2. Технология приготовления гемолизата крови 81
5.3. Изготовление миниколонок с аффинным сорбентом 81
5.4. Приготовление буферных растворов 82
5.5. Проведение анализа определения содержания HbAjc 83
5.6. Регистрация и оценка результатов определения НЬА1с 84
5.7. Регенерация и условия хранения миниколонок с аффинным сорбентом для количественного определения HbAic 85
Глава 6. Экспериментально-клинические испытания тест-системы для количественного определения HbAic... 85
6.1. Определение гликемического статуса пациентов поликлиники УНЦ РАН 85
6.2. Определение НЬА)с у больных сахарным диабетом, отягощенных офтальмологической патологией 86
6,2.1. Определение НЬА|С аффинной тест-системой на основе ПААГ с иммобилизованной .м-АФБК 87
6.2.2. Определение НЬА(с аффинной тест-системой на основе
модифицированной агарозы с иммобилизованной лг-АФБК 88
6.3. Определение НЬА,С аффинной тест-системой на основе ПААГ у пациентов эндокринологического отделения РДКБ 89
6.4. Сравнительная характеристика диагностику мов, использованных для определении НЬА]с 90
6.5. Исследования гликемического статуса онкобольных методом аффинной хроматографии 92
Глава 7. Разработка периодатного метода определения гликозилированного гемоглобина 95
7.1. Определение НЬА методом периодатного окисления с последующей детекцией альдегидных групп реактивом Несслера 97
7.2. Определение НЬА, методом периодатного окисления с последующей рН-метрической детекцией 98
Заключение 101
Выводы 106
Список литературы 108
Приложения
