Введение
Глава . Обзор литературы 15
1.1 Интерферон бета – структура и свойства 15
1.1.1 Структура IFN 15
1.1.2 Системы экспрессии IFN 17
1.1.3 Механизм действия IFN 17
1.1.4 Биологическая активность IFN 20
1.1.5 Терапевтические эффекты лекарственных препаратов на основе IFN 21
1.2 Технологии улучшения фармакокинетических характеристик рекомбинантных терапевтических белков 26
1.2.1 Технология ПЭГилирования 28
1.2.2 ПЭГ-миметики 39
1.2.3. Гликозилирование 48
1.2.4. Технология белок-белкового слияния 55
Глава I. Материалы и методы 70
2.1. Конструирование генно-инженерных конструкций (ГИК) pETm-PAS-IFN1b и pETm-IFN1b-PAS и экспрессия целевых белков в штаммах E.coli 70
2.1.1 Компьютерное моделирование целевых молекул 70
2.1.2 Генно-инженерные методы 70
2.2 Условия экспрессии рекомбинантных белков и фракционирования биомассы 71
2.3 Выделение IFN-1b-PAS из биомассы E.coli 72
2.4 Физико-химическая характеризация IFN1b-PAS 75
2.4.1 Электрофорез в ПААГ/ДСН геле 75
2.4.2 Определение молекулярной массы методом nanoLC-MS с ионизацией в электроспрее 75
2.4.3 Определение кажущейся молекулярной массы (Stoke radius) методом гель-эксклюзионной хроматографии (SEC) 76
2.4.4 Определение вторичной структуры методом кругового дихроизма 77
2.5 Антипролиферативная биологическая активность in vitro 77
2.6 Исследование фармакокинетики IFN1b-PAS200 при внутривенном, подкожном и внутримышечном введении на модельных животных. 78
2.7 Статистическая обработка данных 79
Глава II. Результаты и обсуждение 80
3.1 Дизайн молекулы IFN-1b-PAS и конструирование экспрессионных векторов 80
3.2 Сравнительная экспрессия вариантов ПАСилированного IFN-1b в E.coli 83
3.3 Выделение IFN1b-PAS 88
3.4 Аналитическая характеризация и биологическая активность IFN1b-PAS 89
3.5. Стабильность и растворимость IFN1b-PAS 93
3.6 Исследование фармакокинетических свойств IFN1b-PAS при однократном введении крысам Sprague Dawley 96
3.6.1 Сравнительное исследование фармакокинетики IFN1b-PAS200 и препарата рекомбинантный IFN1b (Инфибета) при однократном внутривенном введении в организм крыс. 96
3.6.2 Сравнительное исследование фармакокинетики IFN1b-PAS200 и препарата рекомбинантного IFN1b (Инфибета) при однократном подкожном и внутримышечном введении в организм крыс . 98
Выводы 102
Список литературы 103
Приложения 125
