Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1. Маннаны растительного сырья и их характеристика 10
1.2. Р-Маннаназы: продуценты, условия биосинтеза
1.2.1. Продуценты р-маннаназ 16
1.2.2. Факторы, влияющие на биосинтез маннаназ при культивировании продуцентов 19
1.3. Генно-инженерные методы в получении высокоактивных продуцентов 23
1.3.1. Общая характеристика метода рекомбинантных ДНК 23
1.3.2. Клонирование и экспрессия маннаназных генов 26
1.4. Получение препаратов р-маннаназы и их характеристика 28
1.4.1. Выделение и очистка Р-маннаназ 28
1.4.2. Физико-химические свойства Р-маннаназ различного происхождения 30
1.4.3. Продукты деструкции маннанов 37
1.4.3.1. Функциональные свойства маннозы
и манноолигосахаридов 38
1.5. Практическое применение р-маннаназ 40
Заключение 43
ГЛАВА 2. Объекты, материалы и методы исследований 45
2.1. Объект исследования и условия его культивирования 45
2.2. Штаммы микроорганизмов, плазмиды и синтетические олигонуклеотиды, используемые в работе 46
2.3. Методы молекулярного клонирования в бактериях
2.3.1. Выделение хромосомной ДНК 47
2.3.2. Выделение плазмиды pBlueScript ks (+) из грамотрицательных микроорганизмов - Е. coli 49
2.3.3. Выделение плазмиды рСВ20 из грамположительных микроорганизмов - В. subtilis 51
2.3.4. Полимеразная цепная реакция 52
2.3.5. Создание генетических конструкций
«клонирующий вектор - встроенная ДНК» 54
2.3.6. Трансформация клеток химическим методом 55
2.3.7. Электрофорез в агарозном геле 56
2.3.8. Выделение ДНК из агарозного геля 57
2.4. Определение активности ферментного препарата 58
2.4.1. Определение активности (3-маннаназы 58
2.4.2. Методы определения активности сопутствующих ферментов 60
2.5. Получение спиртоосажденного фермента 61
2.6. Определение физико-химических свойств фермента 61
2.7. Определение степени гидролиза маннанов 62
2.8. Определение качественного состава продуктов гидролиза 62
2.9. Исследование пребиотических свойств маннозосодержащих гидролизатов 63
2.10. Общие биохимические и микробиологические методы исследования 64
2.11. Статистическая обработка экспериментальных данных 65
ГЛАВА 3. Конструирование рекомбинантного штамма - продуцента р-маннаназы 66
3.1. Выбор объекта клонирования и системы экспрессии 66
3.2. Создание генетических конструкций на основе плазмидного вектора pBlueScript ks (+) 69
3.3. Создание генетических конструкций на основе вектора рСВ20 74
3.4. Выбор наиболее эффективного промотора для экспрессии гена (З-маннаназы 78
3.5. Исследование стабильности рекомбинантного плазмидного штамма B.subtilis 81
ГЛАВА 4. Получение рекомбинантнои р-маннаназы и исследование физико-химических свойств фермента 84
4.1. Подбор оптимальных условий глубинного культивирования рекомбинантного штамма B.subtilis 84
4.2. Получение спиртоосажденного ферментного препарата Р-маннаназы 90
4.3. Технология получения ферментного препарата рекомбинантной В-маннаназы B.subtilis 168 94
4.4. Исследование влияния рН и температуры на активность В-маннаназы 98
4.5. Исследование кинетики кислотной и термической инактивации р-маннаназы 101
Глава 5. Исследование процесса ферментативной деструкции маннанов растительного сырья и определение пребиотических свойств маннозосодержащих гидролизатов 107
5.1. Исследование процесса ферментной деструкции маннанов растительного сырья и идентификация продуктов гидролиза 107
5.2. Изучение пребиотических свойств маннозосодержащих гидролизатов ПО
5.3. Расчет себестоимости Р-маннаназы по предлагаемой технологии 112
Заключение 117
Выводы 119
Список использованных источников 121
