СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ……………………………………….……………….……..……....5
ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………………….………………...…7
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ………………………………………………………………....….12
1.1. Вирус гриппа…………………………………………………..……………...…...…12
1.2. Вирус SARS-CoV-2……………………………………………………………...…..14
1.3. История разработки вакцин от гриппа……………………………………….….....16
1.4. Виды вакцин против гриппа на современном этапе …………………………...…17
1.5 Разрабатываемые новые типы вакцин…………………………………………..….19
1.6 Вакцины против COVID-19…………………………………………….…….……..22
1.7 мРНК-вакцины………………………………………………………….….….……..23
1.7.1 Общие сведения………………………………………….………….….……23
1.7.2 Структура мРНК-вакцины………………………………………….……....26
1.7.2.1 Кэп………………………………………………………………..…..26
1.7.2.2 5’Нетранслируемый регион (5’НТО)………………………….…...30
1.7.2.3 Кодирующая область……………………………………………..…31
1.7.2.4 3’Нетранслируемый регион (3’НТО)…………………………..…..35
1.7.2.5 Поли(А)хвост……………………………………….…..………..….36
1.7.3 Механизм работы мРНК-вакцины………………………………..………..37
1.7.4 Взаимодействие мРНК с системой врожденного иммунитета………..…39
1.7.5 Доставка мРНК-вакцины………………………………………………...…42
1.8 Разрабатываемые мРНК-вакцины против гриппа и COVID-19.............................45
1.9 Заключение по обзору литературы………………………………..….……......…..46
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ……………………………………………….….………...…47
2.1. Материалы …………………………………………………………………...……....47
2.1.1. Плазмиды, штаммы бактерий, культуры клеток…………………...……....47
2.1.2. Лабораторные животные……………………………………………...……..47
2.1.3. Олигонуклеотиды……………………………………………………..….…..48
2.1.4. Нуклеотидные последовательности нетранслируемых областей……...….49
2.1.5. Коммерческие наборы, ферменты и реактивы……………………...…...…50
2.1.6. Растворы и буферы………………………………………………………..…51
2.2. Методы………………………………………………………………………….....…52
2.2.1. Получение ПЦР-продуктов для клонирования в плазмидный вектор pVAX,
pVAX-C1, pVAX-C2, pVAX-C3 и др ……….…………………………………………......…...52
3
2.2.2. Электрофоретический анализ плазмидной ДНК или мРНК в агарозном
геле……...................................................................................................................................…..53
2.2.3. Измерение концентрации нуклеиновых кислот…………...……………….53
2.2.4. Получение ДНК-матриц для синтеза мРНК……..………………..………..53
2.2.5. Подготовка матрицы для синтеза мРНК……………...…………………….54
2.2.6. Синтез мРНК in vitro………………………………….………………..……54
2.2.7. Трансфекция клеток HEK293 мРНК-GFP……….………………..………..55
2.2.8. Электрофорез и иммуноблотинг культуральной среды после трансфекции
клеток мРНК…………………………………………………………………………………….56
2.2.9. Моделирование вторичной структуры НТО мРНК.……………….……...56
2.2.10. Очистка мРНК от примесей дцРНК…………………..…………..…….…57
2.2.11. Анализ мРНК на биоанализаторе Agilent 2100 BioAnalyse.…………....…57
2.2.12. Дот-блот анализ дцРНК……………………………………………………..57
2.2.13. Определение уровня IFN-α………………………………………….…...….58
2.2.14. Выделение спленоцитов…………………………………………………….58
2.2.15. Определение маркера активации лимфоцитов CD 69……………..….......58
2.2.16. Иммунизация лабораторных животных для оценки эффективности
экспериментальных мРНК вакцин ……………………………………………………………59
2.2.17. Иммуноферментный анализ……………………………………….…….…60
2.2.18. ELISPot…………………………………………………………………..…..60
2.2.19. Реакция вируснейтрализации ………………………………...…….…...…61
2.2.20. Оценка защитной эффективности мРНК-вакцины против гриппа на
инбредных мышах………………………………………………………………………………61
2.2.21. Оценка защитной эффективности мРНК-вакцины против COVID-19 на
инбредных мышах……………………………………………………….…………….………..62
2.2.22. Статистическая обработка результатов……………………….……...……62
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ………………………………………….……….……...63
3.1. Конструирование ДНК-матриц для синтеза мРНК………………………..………63
3.1.1. Кэпирование и полиаденилирование мРНК ферментативным
способом…………………………………………………………………………….………..…63
3.1.2. Кэпирование и полиаденилирование РНК котранскрипционным
способом…………………………………………………………………………………..…….66
3.1.3. Выбор нетранслируемых областей для повышения эффективности
трансляции мРНК……………………………………………………………………………….70
3.1.3.1. Моделирование вторичной структуры НТО мРНК..……………..71
4
3.1.3.2. Получение универсальных ДНК-матриц для синтеза мРНК.……77
3.2. Очистка мРНК от примесей дцРНК.………………………...…………..………….80
3.2.1.Оценка очистки мРНК от примесей дцРНК in vitro………………….….....82
3.2.2.Оценка очистки мРНК от примесей дцРНК in vivo………………...………84
3.3. Разработка экспериментальной мРНК-вакцины против гриппа…………….…....86
3.3.1. Конструирование матрицы для синтеза мРНК-C3-H1………………..…...86
3.3.2.Синтез мРНК-C3-H1………………………………………………….….…...87
3.3.3.Анализ трансляции мРНК-С3-H1 в трансфицированных клетках
HEK-293……………………………………………………………………..……...….……..…..87
3.3.4.Иммунизация лабораторных животных………………………….….……....88
3.3.5.Оценка иммунного ответа………………………………………….…….…..89
3.4. Разработка экспериментальной мРНК-вакцины против COVID-19…….……......94
3.4.1.Конструирование матрицы для синтеза мРНК-C1-RBD…………….…..…94
3.4.2.Синтез мРНК-C1-RBD………………………………………..……..…….….95
3.4.3.Анализ экспрессии мРНК-С1-RBD в трансфицированных клетках
HEK-293……………………………………………………………...…………………....……...95
3.4.4.Оценка иммунного ответа…………………………………..….….……….....96
ЗАКЛЮЧЕНИЕ…………………………………………………………….……………...……102
ВЫВОДЫ……………………………………………………………………………….....…....104
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ……………………………………………………….………..……105
