Введение
Глава 1. Обзор литературы (физико-химические методы при выделении и определении антимикробных пептидов) 12
1.1. Физико-химические закономерности разделения и определения антимикробных пептидов 12
1.1.1. Гель-проникающая колоночная хроматография и твердофазная экстракция как начальные этапы очистки пептидов 12
1.1.2. Применение ВЭЖХ для установления физико-химических характеристик удерживания пептидов и условий их определения на силикагеле С18 и пористом графитированном углероде Гиперкарб 14
1.1.3. ВЭЖХ исследование пептидов на катионообменных носителях 19
1.1.4. Физико-химические основы хроматографической идентификации пептидов 22
1.1.5. Физико-химические характеристики удерживания и их корреляции со свойствами исследуемых молекул 30
1.2. Физико-химические основы масс-спектрометрии пептидов 35
1.2.1. Основные используемые в масс-спектрометрии пептидов методы ионизации и типы масс-анализаторов 35
1.2.2. Пробоподготовка и ионизация пептидов в методе МАЛДИ 43
1.2.3. Особенности фрагментации пептидов в условиях получения МАЛДИ-МС/МС спектров 49
1.2.4. Структурная информация, получаемая на основе МС/МС спектров и ее использование для идентификации пептидов 54
1.2.5. Масс-спектр как физико-химическая характеристика пептида 57
1.3. Антимикробные пептиды: свойства, значение и механизмы действия 60
1.3.1. Значение и свойства антимикробных пептидов 60
1.3.2. Пептиды в насекомых 61
1.3.3. Биологическое тестирование 64
Глава 2. Экспериментальная часть 67
2.1. Реагенты и оборудование 67
2.2. Объекты и пробоподготовка 68
2.3. Методики проведения физико-химического эксперимента 73
Глава 3. Результаты и обсуждение 79
3.1. Оценка эффективности пробоподготовки 79
3.2. Антимикробный тест и его результаты 80
3.3. Сравнение различных физико-химических методов хроматографирования пептидов и выбор оптимальных хроматографических условий 82
3.3.1. Катионообменная гель-хроматография пептидов гусеницы Galleria mellonella на сефадексе СМ-50 82
3.3.2. Сравнительное исследование пептидных фракций гусеницы Galleria mellonella методом обращенно-фазовой ВЭЖХ 83
3.3.3. Катионообменное ВЭЖХ исследование пептидов Galleria mellonella 89
3.3.4. ВЭЖХ исследование пептидов гусеницы Galleria mellonella на сорбенте Гиперкарб и молекулярно-статистическая оценка теплот адсорбции пептидов 93
3.3.5. Физико-химические характеристики удерживания, используемые для построения корреляций со свойствами исследуемых пептидов 96
3.4. Сравнительное масс-спектрометрическое исследование и идентификация пептидов 109
3.4.1. Изучение антибактериальных пептидных фракций после катионообменной гель-хроматографии методом МАЛДИ 109
3.4.2. Изучение пептидного состава фракций после обращенно-фазовой ВЭЖХ для разных пептидных смесей 110
3.4.3. Изучение пептидного состава фракций после катионообменной ВЭЖХ для разных пептидных смесей 123
3,4.4, Идентификация пептидов Galleria mellonella по базам данных 124
3.4.6. Гидролиз пептидов трипсином в антибактериальных фракциях и масс-спектрометрическое изучение продуктов гидролиза 143
3.4.7. Применение алгоритмов секвенирования de novo для идентификации пептидов гусеницы Galleria mellonella 155
3.4.8. Физико-химическая характеристика пептидов на основе масс-спектрометрических данных. МС/МС спектры 160
3.5. Сочетание хроматографической и масс-спектрометрической идентификации 166
Заключение 171
Выводы 173
Благодарности 174
Список литературы 175
