Введение
Глава 1 Обзор литературы 8
1.1. Изготовление микрочипов 8
1.2 Иммобилизация белков 10
1.2.1 Адсорбционная иммобилизация 11
1.2.2 Химическая (ковалентная) иммобилизация белков 13
1.2.2.1 Иммобилизация по аминогруппам белка 14
1.2.2.2 Иммобилизация по сульфгидрильным группам белка 15
1.2.2.3 Иммобилизация через декстрановые спейсеры 16
1.2.3 Иммобилизация за счет комплексообразования 17
1.2.4 Иммобилизация в пористых средах 18
1.2.5 Иммобилизация белков на трехмерных гидрофильных носителях 19
1.2.6 Иммобилизация на полимерных носителях 19
1.2.7 Иммобилизация в полиакриламидном геле 20
1.3 Применение микрочипов 22
1.3.1 Аналитические микрочипы 25
1.3.2 Функциональные микрочипы 29
1.3.2.1 Белок-белковые взаимодействия 29
1.3.2.2 Белок-липидные взаимодействия 31
1.3.2.3 Белок-ДНК - взаимодействия 31
1.4 Модельные белки 33
1.4.1 Барназа 33
1.4.2 Раково-эмбриональный антиген (РЭА) 35
1.5 Методы ускорения анализа на микрочипах 38
ГЛАВА 2 Экспериментальная часть 44
2.1 Приборы и реактивы 44
2.2 Изготовление белковых микрочипов 45
2.3 Окрашивание белков флуоресцентными красителями 46
2.4 Флуоресцентные измерения на чипах 46
2.5 Введение метакрильных групп в белок 47
2.6 Оценка эффективности иммобилизации барназы на микрочипе. 48
2.7 Оценка сохранения биологической активности модифицированной барназы на примере взаимодействия с барстаром 48
2.8 Модификация белка мономерами геля 49
2.9 Исследование ферментативной активности иммобилизованной
на микрочипе барназы методом MALDI-TOF MS 49
2.10 Прямой масс-спектральный анализ барстара на микрочипах 50
2.11 Определение содержания рекомбинантного барстара в лизатах клеткок 51
2.12 Сэндвич-иммуноанализ РЭА 51
2.13 Кинетические измерения на микрочипах 52
ГЛАВА 2 Результаты и их обсуждение 54
3.1 Белковые микрочипы 54
3.2 Изготовление гелевых микрочипов 55
3.3 Регистрация сигналов гелевых ячеек микрочипа 56
3.4 Введение в молекулу барназы непредельных групп 57
3.5 Оценка эффективности иммобилизации 58
3.6 Исследование влияния введения непредельных групп в молекулу белка на сохранение им биологической активности 60
3.7 Метод полимеризационной иммобилизации 62
3.8 Исследование ферментативной активности иммобилизованной на микрочипе барназы 67
3.9 Количественный флуориметрический анализ барстара на 69 микрочипах
3.10 Определение содержания рекомбинатного барстара в л изатах клеток 72
3.11 Прямой масс-спектральный анализ барстара на микрочипах 73
3.12 Разработка процедуры сэндвич-иммуноанализа на белковых микрочипах (на примере РЭА) 74
3.13 Подбор условий проведения иммуноанализа 78
3.14 Одностадийный сэндвич-иммуноанализ РЭА на микрочипах... 79
3.15 Сэндвич анализ РЭА в сыворотках крови 80
3.16 Ускорение иммуноанализа на микрочипе с помощью механического перемешивания образца 82
3.17 Зависимость интенсивности сигнала и времени выхода на насыщение кинетической кривой от скорости перемешивания на перистальтическом насосе 84
3.18 Получение калибровочных кривых при проведении анализа с механическим перемешиванием образца 87
Выводы 89
Благодарности 90
Список литературы
