Введение
1. Обзор литературы 12
1.1. Метапневмовирусная инфекция птиц 12
1.1.1. Исторические и эпизоотологические данные 12
1.1.2. Патогенез
1.1.2.1. Клинические признаки 15
1.1.2.2. Тропизм вируса и патологоанатомические изменения 17
1.1.2.3. Иммунитет при метапневмовирусной инфекции птиц 18
1.1.3. Специфическая профилактика 20
1.2. Характеристика МПВ птиц 22
1.2.1. Классификация 22
1.2.2. Строение и состав 25
1.2.3. Свойства 29
1.2.4. Устойчивость к физическим и химическим факторам 30
1.2.5. Цикл репродукции 32
1.3. Диагностика метапневмовирусной инфекции птиц 33
1.3.1. Молекулярные методы диагностики 33
1.3.2. Выделение вируса 36
1.3.3. Серологические методы диагностики 38
1.3.4. Гибридомная технология 39
1.4. Заключение по обзору литературы 40
2. Собственные исследования 42
2.1. Материалы и оборудование 42
2.1.1. Образцы патологического материала 42
2.1.2. Штаммы микроорганизмов 42
2.1.3. Сыворотки и пероксидазные конъюгаты антител 42
2.1.4. Последовательности МПВ птиц из базы данных GenBank 43
2.1.5. Ферменты и дезоксинуклеозидтрифосфаты 44
2.1.6. Праймеры 45
2.1.7. Животные 46
2.1.8. Культуры клеток 46
2.1.9. Среды для культивирования
2.1.10. Химические реагенты, растворы, буферные смеси 47
2.1.11. Оборудование 48
2.1.12. Расходные материалы 49
2.1.13. Коммерческие наборы 50
2.2. Методы исследований 50
2.2.1. Выбор праймеров и TaqMan-зондов 50
2.2.2. Выделение нуклеиновых кислот 50
2.2.3. ОТ-ПЦР-РВ 50
2.2.4. Обратная транскрипция и ПЦР 50
2.2.5. Очистка продуктов ПЦР 51
2.2.6. Секвенирование 52
2.2.7. Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей...52
2.2.8. Выделение МПВ птиц в трахеальной органной культуре 52
2.2.9. Электрофорез белков и иммуноблоттинг 2.2.10. Иммуноцитохимический анализ 54
2.2.11. Приготовление перитонеальных макрофагов мыши 54
2.2.12. Культивирование гибридом in vitro 54
2.2.13. Клонирование гибридом методом лимитирующих разведений .55
2.2.14. Культивирование гибридом in vivo 55
2.2.15. Замораживание, размораживание и хранение гибридом 56
2.2.16. Определение титра инфекционной активности вируса в культурах клеток и органов 56
2.2.17. Непрямой твердофазный вариант ИФА 56
2.2.18. Непрямой твердофазный «сэндвич»-вариант ИФА 57
2.2.19. Статистическая обработка результатов 57
3. Результаты собственных исследований и их обсуждение 58
3.1. Разработка ОТ-ПЦР (ген К) для выявления генома МПВ птиц подтипов А и В 58
3.2. Разработка ОТ-ПЦР в режиме реального времени для выявления генома МПВ птиц подтипов А и В 61
3.3. Исследование образцов патологического материала на наличие генома МПВ птиц в 2005-2010 гг 66
3.4. Выделение МПВ птиц в трахеальной органной культуре 72
3.5. Изучение биологических свойств изолята aMPV/В/02/2007 МПВ птиц 75
3.6. Использование моноклопальных антител в твердофазном непрямом «сэндвич»-варианте ИФА для выявления антигена МПВ птиц 78
3.6.1. Характеристика моноклональных антител к МПВ птиц 79
3.6.2. Разработка твердофазного непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для выявления антигена МПВ птиц
3.7. Анализ последовательностей фрагментов генов О и N изолятов МПВ птиц 88
3.8. Анализ полных последовательностей генов О, Р и N изолятов МПВ птиц
4. Заключение ПО
5. Выводы 114
6. Практические предложения 115
7. Список использованной литературы
