Введение
Глава 1. Разнообразие и классификация хламидии 12
1.1. Общая характеристика представителей семейства Chlamydiaceae 12
1.2. Систематика хламидии 14
1.2.1. Развитие классификации 14
1.2.2. Современная классификация и таксономия представителей семейства Chlamydiaceae и их роль в развитии заболеваний 16
Глава 2. Современные методы выявления и типирования хламидии 22
2.1, Немолекулярные методы 22
2.1.1. Морфологические методы 23
2.1.2. Культивирование 23
2.1.3. Иммунологические методы 24
2.2. Молекулярно-генетические методы 28
2.2.1. Выбор генетических локусов для выявления представителей семейства Chlamydiaceae 30
2.2.2. Молекулярно-генетические методы, используемые для дифференциации видов Chlamydiaceae 35
Глава 3. Материалы и методы исследования 45
3.1. Характеристика штаммов ..45
3.2. Модельные и клинические образцы, использованные для оптимизации ПЦР и выявления хламидии 45
3.3. Выделение ДНК для ПЦР 47
3.3.1. Быстрое выделение ДНК с использованием Chelex-100 „47
3.3.2. Выделение ДНК с использованием протеиназы К 47
3.3.3. Выделение ДНК с помощью сорбционного метода 47
3.4. ПЦР-амплификация фрагмента генаотирЛ 48
3.5. Клонирование и определение нуклеотидных последовательностей амплификационных фрагментов отрА различных видов Chlamydiaceae...49
3.6. Получение гетерогенного внутреннего стандарта ПЦР 51
3.7. Электрофоретическое разделение амплификационных фрагментов отрА в присутствии бисбензимида-ПЭГ 53
3.8. ПЦР в режиме реального времени с SYBR Green I и анализ кривых плавления 53
3.9. Мультиплексная ПЦР в режиме реального времени с использованием зондов TaqMan-типа (5 -экзонуклеазный метод) 54
3.10. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей 55
Глава 4. Результаты и обсуждение 57
4.1. ПЦР-амплификация и анализ фрагмента последовательности от различных видов хламидий 57
4.1.1. Выбор праймеров и оптимизация ПЦР 57
4.1.2. Клонирование амплификационных фрагментов отрА и характеристика их нуклеотидных последовательностей 59
4.2. Разработка и получение внутреннего стандарта ПЦР 62
4.3. Дифференциация представителей Chlamydiaceae путем электрофоретического разделения в геле с добавлением бисбензимида-ПЭГ .65
4.4. Выявление и типирование представителей семейства Chlamydiaceae с помощью ПЦР в режиме реального времени и анализа кривых плавления с SYBR Green I 72
4.5. Идентификация Chlamydia spp., Chlamydophilapneumoniae и возбудителей зоонозных хламидиозов с помощью мультиплексной TaqMan ПЦР в режиме реального времени 75
4.6. Анализ чувствительности и специфичности разработанных методов при исследовании клинических образцов 80
Заключение 85
Выводы 90
Практические рекомендации 91
Литература 93
