Введение
II Обзор литературы 10
1 Значение фитаз для кормопроизводства 10
2 Классификация и свойства фитаз 12
2.1 Фитазы семейства кислых гистидиновых фосфатаз 13
2.1.1 Грибные фитазы 15
2.1.2 Бактериальные фитазы 17
2.2 Фитазы семейства пирофосфотаз ф-пропеллерных фитаз) 19
2.3 Фитазы семейства пурпурных кислых фосфатаз 20
3 Промышленно важные характеристики фитаз 21
4 Подходы к конструированию ферментов с улучшенными характеристиками 25
4.1 Принципы рационального конструирования белков 26
4.2 Принципы «направленной эволюции» 30
4.3 Принципы «полурационалыюго» конструирования белков 34
5 Экспрессия фитаз в различных системах 41
5.1 Экспрессия фитаз в бактериях 41
5.2 Экспрессия фитаз в грибах 41
5.3 Экспрессия фитаз в дрожжах 42
6 Методы синтеза генов 45
III Материалы и методы 48
1 Среды и условия культивирования 48
2 Штаммы, плазмиды и олигонуклеотиды 49
3 Манипуляции с ДНК 52
4 Конструирование плазмид для экспрессии генов фитаз 53
5 "Errore-prone" ПЦР, конструирование библиотеки мутантных генов 53
6 Отбор фитаз с повышенной термостабильностью 54
7 Сайт-направленный и сайт-направленный насыщающий мутагенез 54
8 Мутагенез областей K29-G74 и Q104-Q131, конструирование библиотеки мутантных генов 55
9 Метод синтеза remphyA-Cfmod из олигонуклеотидов 56
10 Определение фитазной активности 57
11 Определение свойств фитаз 58
12 Анализ аминокислотных последовательностей и мутаций 59
IV Результаты и обсуждение 60
1 Применение стратегии случайного мутагенеза целой днк последовательности для получения генов фитаз с. freundi1с повышенной термостабильностью 60
1.1 Получение генов, кодирующих фитазы C.freundii с повышенной термостабильностью, методом "error-prone" ПЦР 60
1.1.1 Выбор объекта для мутагенеза 60
1.1.2 Разработка экспрессионной системы и выбор реципиента 62
1.1.3 Проведение мутагенеза методом "error-prone"ПЦР 62
1.1. 4 Разработка метода отбора фитаз с повышенной термостабильностью 63
1.1.5 Отбор фитазы с повышенной термостабильностью 64
1.1.6 Оценка эффективности метода 66
1.2. Оценка возможности применения метода ДНК-"шаффлинга" для создания генов фитаз C.freundii с повышенной термостабильностью 66
2. Применение стратегии сфокусированного мутагенеза для создания генов фитаз с повышенной термостабильностью и высокой удельной активностью.67
2.1 Выбор реципиента и системы экспрессии 67
2.1.1 Выбор реципиента 68
2.1.2 Получениерекомбинантных плазмид рРЮ-С и рРЮ-0 и штаммов на их основе 69
2.2 Разработка полурационального подхода для получения генов термостабильных фитаз 70
2 2.1. Получение, клонирование, экспрессия генов phyA-CMl и phyA-OMl 73
2.2.2 Определение свойств фитаз РІтуА-CfMl и PhyA-OpMl 73
2.2.2.1 Определение молекулярной массы 73
2.2.2.2 Сравнение термостабильности 74
2.2.2.3 Оценка удельной активности 79
2.2.3 Получение, клонирование и экспрессия генаphyA-Cl 80
2.3 Получение генов, кодирующих термостабильные фитазы с увеличенной удельной активностью 81
2.3.1 Получение генов на основе мутагенеза ДНК последовательности phyA-CMl 81
2.3.2 Получение генов на основе мутагенеза ДНК последовательности phyA-Cl 83
2.3.2.1 Выбор мутаций с помощью программы I-Mutant2,0 83
2.3.2.2 Получение, клонирование и экспрессия геновphyA-C(2-6) 84
3. Разработка эффективного подхода для получения гена, кодирующего мутантный вариант фитазы с оптимизированными свойствами 85
3.1 Разработка подхода и теоретическое обоснование его эффективности 85
3.2 Получение генаphyA-СМЗ в результате применения разработанного подхода 88
3.3 Анализ аминокислотных замен 89
4. Изучение свойств фитазы PHYA-CFM3 92
4.1 Анализ термостабильности 92
4.2 Определение молекулярной массы и удельной активности 93
4.3 Определение оптимальной рабочей температуры и рН профиля 95
4.4 Влияние гликозилирования и рН на термостабильность и фитазную активность 96
4.5 Определение кинетических характеристик 97
4.6 Оценка кормовых качеств фитазы PhyA-CfM3 98
5. Эффективная экспрессия гена PHYA-CM3MOD в дрожжах P. pastoris 99
5.1. Разработка синтетической последовательности гена phyA-Cmod 99
5.2 Разработка метода синтеза гена phyA-Cmod 100
5.3 Влияние оптимизации кодонов на эффективность экспрессии rem phyA-Cmod 103
5.4 Получение штамма P. pastoris с повышенной экспрессией гена phyA-CM3mod. 104
5.4 Сравнение фитазных активностей КЖ лучших штаммов после прогрева 104
V Выводы 105
VI Список литературы 106
