Введение
ЧАСТЬ 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
1. Проблема определения видовой принадлежности мясных ингридиентов 10
2. Молекулярные методы определения видовой принадлежности мясных ингредиентов в кормах 12
3. Принцип полимеразной цепной реакции 14
4. Подбор праймеров 15
4.1. Дизайн праймеров 15
4.2. Температура отжига. 16
4.3. Длина праймеров. 16
4.4. Вырождение праймеры 17
5. Факторы воздействующие на ПЦР 18
5.1. Температура и время денатурации 18
5.2. Температура и время элонгации 19
5.3. Реакционный буфер 19
5.4. Количество циклов амплификации 20
5.5. «Горячий старт» ПЦР. 20
5.6. Контаминация в ПЦР и предложения по обустройству ПЦР-лаборатории 21
5.8. Внутренний контрольный образец (ВКО) 23
ЧАСТЬ 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 25
ГЛАВА 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 25
1. Базы данных нуклеотидных последовательностей ДНК и компьютерные программы для обработки этих данных 25
2. Образцы-сравнения ДНК. 25
2.1. Коммерческие препараты ДНК. 25
2.2. Самостоятельно полученные образцы ДНК из цельной крови животных 26
3. Образцы кукурузной, куриной, рыбной и мясокостной муки 26
3.1. Отбор образцов 26
3.2. Приготовление смесей 26
3.3. Перечень видов смесей кормовой муки 26
4. Образцы сухого и консервированного корма для животных 27
5. Образец сыворотки лошадей 27
6. Методика выделения ДНК из цельной крови по maniatis (94) 27
6.1. Выборочный лизис эритроцитов: 27
6.2. Обработка лейкоцитарного осадка протеиназой К. 28
6.3. Экстракция ДНК фенол-хлороформом с последующей преципитацией этанолом 28
7. Оценка концентрации Днк спектрофотометрическим методом (94) 29
8. Методика выделения Днк сорбцией на селикагеле по boom (24) 29
9. Методика проведения реакции амплификации 30
9.1. Состав реакционной смеси, условия амплификации 30
9.2. «Горячий старт» 30
10. Методика проведения электрофореза в агарозном геле 31
11. Методика определения говядины в образцах методом ифа 31
ГЛАВА 2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 32
1. Выбор олигонуклеотидных праимеров для дифференциальной амплификации ДНК говядины и баранины 32
2. Изучение специфичности выбранных праимеров 32
3. Подбор условий ПЦР 33
3.1. Оптимизация температуры отжига специфических олигонуклеотидов (праимеров) 33
3.2. Подбор концентрации праимеров 34
3.3. Применение «горячего старта» 35
4. Определение чувствительности и специфичности выбранной системы амплификации 35
5. Подбор методов выделения (очистки) ДНК из муки 36
6. Внутренний контрольный образец (BKO) 38
7. Отрицательные и положительные контрольные образцы 39
8. Состав разработанной тест-системы 40
9. Определение чувствительности и специфичности разработанной тест-системы 41
10. Сравнение чувствительности методов ПЦР и ифа 42
11. Комиссионные испытания пцр-тест-системы «биг» 43
12. Изучение активности и стабильности пцр-тест-системы в зависимости от срока хранения 44
13. Эпизоотическая статистика при тестировании кормов на днк жвачных животных методом ПЦР в России 45
ОБСУЖДЕНИЕ 46
ВЫВОДЫ 52
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 53
РИСУНКИ 54
ТАБЛИЦЫ 67
ЛИТЕРАТУРА 79
ПРИЛОЖЕНИЯ 93
