Введение
Глава 1. Обзор литературы 15
1.1. Патофизиология ревматоидного артрита 15
1.1.1. Краткие сведения об этиологии и иммунопатогенезе ревматоидного артрита 15
1.1.2. Т-клеточное звено иммунитета в патогенезе ревматоидного артрита 18
1.1.2.1. Характеристика популяций Т-клеток при ревматоидном артрите. Тh1/Th2-клеточная парадигма 20
1.1.2.2. Тh17/Th1-клеточная парадигма 23
1.1.2.3. Тh17/Treg-клеточная парадигма 26
1.1.3. Созревание Т-лимфоцитов и феномен иммунологического старения при ревматоидном артрите 29
1.1.3.1. Краткая характеристика и функциональные особенности субпопуляций Т-клеток иммунной памяти 29
1.1.3.2. Аспекты старения иммунной системы. Инволюция тимуса и изменения и изменения Т-клеточного звена в патогенезе ревматоидного артрита 32
1.1.3.3. Феномен иммунологического старения и его связь с патогенезом ревматоидного артрита 36
1.2. Краткая характеристика глюкокортикостероидов 41
1.2.1. Строение цитозольного рецептора к глюкокортикоидам (GR) и его транслокация в ядро 41
1.2.2. Процессы, происходящие с GR в ядре. Изменение экспрессии генов 42
1.2.3. Применение глюкокортикоидов в лечении аутоиммунных заболеваний 45
Глава 2. Материал и методы исследований 49
2.1. Объект и материал исследования 49
2.2. Методы исследования 50
2.2.1. Выделение мононуклеарных лейкоцитов из периферической крови 52
2.2.2. Выделение CD3+CD45RO+ Т-лимфоцитов из фракции мононуклеарных лейкоцитов методом иммуномагнитной сепарации 52
2.2.3. Культивирование CD3+CD45RO+ клеток 55
2.2.4. Определение общего числа клеток (в мл) и количества живых лимфоцитов в культурах CD3+CD45RO+ Т-клеток методом проточной цитометрии 57
2.2.5. Определение поверхностных маркеров CD25, CD28, CD71, CD45RA, CD95, HLA-DR на CD3+CD4+CD45RO+ Т-клетках методом проточной цитометрии 58
2.2.6. Определение содержания концентрации провоспалительных молекул (IL-2, IL-17, IL-21, IFN-y и TNF-a) в супернатантах культур CD3+CD45RO+ Т-клеток 62
2.2.7. Выделение тотальной РНК 63
2.2.8. Обратная транскрипция образцов тотальной РНК 65
2.2.9. Определение уровня относительной экспрессии генов методом количественной ПЦР в режиме реального времени. 66
2.2.9.1. Количественная ПЦР в реальном времени с использованием интеркалирующего красителя 66
2.2.9.2. Мультиплексная количественная ПЦР в реальном времени 70
2.2.10. Методы статистического анализа данных 73
Глава 3. Результаты собственных исследований 76
3.1. Оценка эффектов синтетических глюкокортикоидов (дексаметазона, метилпреднизолона) на общее количество (106/ мл) и содержание живых (%) клеток в культурах TCR - активированных CD3+CD45RO+ Т лимфоцитов у здоровых доноров и больных ревматоидным артритом 76
3.2 Оценка эффектов синтетических глюкокортикоидов (дексаметазона, метилпреднизолона) на экспрессию мембранных молекул ранней активации (CD25), коактивации (CD28), пролиферации (CD71), поздней активации (HLA-DR) и апоптоза (CD95) и CD45RA в культурах TCR-активированных CD3+CD45RO+ Т-лимфоцитов у здоровых доноров и больных ревматоидным артритом 79
3.2.1. Мембранная экспрессия молекулы ранней активации CD25 79
3.2.2. Мембранная экспрессия молекулы ко-стимуляции CD28 81
3.2.3. Мембранная экспрессия молекулы пролиферации CD71 83
3.2.4. Мембранная экспрессия молекулы апоптоза CD95 85
3.2.5. Мембранная экспрессия молекулы поздней активации HLA-DR 87
3.2.6. Оценка эффектов синтетических глюкокортикоидов (дексаметазона, метилпреднизолона) на изменение числа CD3+CD4+CD28-CD95+HLA-DR+ CD45RO- в культурах TCR - активированных CD3+CD45RO+ Т-лимфоцитов у здоровых доноров и больных ревматоидным артритом 89
3.3. Оценка эффектов синтетических глюкокортикоидов (дексаметазона, метилпреднизолона) на продукцию провоспалительных медиаторов (IL-2, IFN-y, IL-17, IL-21, TNF-) TCR - активированными CD3+CD45RO+ Т лимфоцитами у здоровых доноров и больных ревматоидным артритом 90
3.3.1. Продукция IL-2 90
3.3.2. Продукция IFN-y 92
3.3.3. Продукция IL-17 94
3.3.4. Продукция IL-21 95
3.3.5. Продукция TNF- 97
3.4. Оценка эффектов синтетических глюкокортикоидов (дексаметазона, метилпреднизолона) на уровень экспрессии мРНК генов провоспалительных медиаторов (IL-2, IFN-y, IL-17, IL-21, TNF-) в TCR активированных CD3+CD45RO+ Т-лимфоцитах у здоровых доноров и больных ревматоидным артритом 99
3.4.1. Экспрессия мРНК гена IL-2 99
3.4.2. Экспрессия мРНК гена IFN-y 100
3.4.3. Экспрессия мРНК гена IL-17 101
3.4.4. Экспрессия мРНК гена IL-21 103
3.4.5. Экспрессия мРНК гена TNF- 104
3.5. Оценка эффектов синтетических глюкокортикоидов (дексаметазона, метилпреднизолона) на уровень экспрессии мРНК каталитической субъединицы фермента теломеразы (hTert) в TCR-активированных CD3+CD45RO+ Т-лимфоцитах у здоровых доноров и больных ревматоидным артритом 105
Глава 4. Обсуждение полученных результатов 107
Выводы 132
Список литературы 133
