Введение
Глава 2. Обзор литературы 8
2.1. Передача сигнала от рецептора egf 8
2.1.1. Факторы роста и их рецепторы 8
2.1.2. Эпидермальный фактор роста (egf), другие факторы egf-семейства и рецепторы семейства ERBB
2.1.3. Пути передачи сигнала от рецепторов факторов роста 13
2.1.3.1. Ras и мар-киназа erk 14
2.1.3.2. Стрессорные мар-киназы 14
2.1.3.3. Фосфатидилинозитол-з-киназа(рі-з-киназа) 15
2.1.3.4. Фосфолииаза с у 16
2.1.3.5. Малые регуляторные гтфазы семейства rho 17
2.1.3.6. Нерецепторные тирозинкиназы 17
2.1.3.7. Транскрипционные факторы семейства nfkb/rel 18
2.1.3.8. Активные формы кислорода 18
2.1.3.9. Негативная регуляция передачи сигнала от факторов роста 19
2.1.4. Активация сигнальных путей рецептором egf. 19
2.1.5. Механизмы регуляции пролиферации клеток при действии факторов роста 22
2.1.5.1. Клеточный цикл 22
2.1.5.2. Методы исследования клеточного цикла 26
2.1.5.3. Сигнальные пути регуляции клеточного цикла факторами роста 27
2.1.6. Механизмы регуляции апоптоза при действии факторов роста 29
2.1.6.1. Лпотоз 29
2.1.6.2. Методы исследования апоптоза 33
2.1.6.3. Сигнальные пути регуляции апоптоза факторами роста 34
2.1.7. Рецепторы семейства erbb в онкогенезе 35
2.2. Транскрипционные факторы семейства stat 39
2.2.1. Строение и активация транскрипционных факторов семейства stat 39
2.2.2. Действие транскрипционных факторов семейства stat на клетку и транскрипционные мишени stat-белков 41
2.2.3. Дополнительные механизмы регуляции активности stat-белков 43
2.2.3.1. Активация фосфорилированием по тирозину 44
2.2.3.2. Регуляторное фосфорилирование по серину 45
2.2.3.3. Димеризация, взаимодействие с днк, активация транскрипции 45
2.2.3.4.1 Негативная регуляция stat-нути 47
2.2.3.5. Другие механизмы регуляции 48
2.2.4. Механизмы активации транскрипционных факторов семейства stat рецептором egf. 50
2.2.5. Регуляция пролиферации и апоптоза транскрипционными факторами семейства sta т 53
2.3. Клетки эпидермоидной карциномы а431 57
2.3.1. Характеристика клеток А431 57
2.3.2. Действие EGF на клетки А431 59
2.3.3. Клепальные варианты клеток А431, устойчивые к действию EGF 65
2.3.4. Другие EGF-чувствительные клеточные линии 66
2.4. Исследование функций белков методом рнк-интерференции 68
ГЛАВА 3. Материалы и методы 72
3.1. Культивирование клеток 72
3.2.Плазмиды 72
3.3.. Трансфекции 73
3.4. Электрофорез и иммуноблоттинг 74
3.5. Антитела 74
3.6. Оценка жизнеспособности клеток (МТТ) 75
3.7. Подсчет числа клеток 75
3.8. Микроскопия 76
3.9. Анализ олигонуклеосомной фрагментации ДНК 77
3.10. Проточная цитометрия 77
Глава 4. Результаты 79
4.1. Egf индуцирует остановку клеток а431 в фазах клеточі юго цикла g2 и g1 и последующую апоптотическую гибель (бурова и др., 2001; грудинки;! И др., 2003; grudinkin ет al., 2007) 79
4.2. Исследование клональных вариантов клеток а431, устойчивых к действию egf 84
4.2.1. В клетках клональных вариантов 1а, 8а и па снижено количество и фосфорилирование транскрипционного фактора stat1 (грудинкин и др., 2003) 84
4.2.2. Трансфекция stat1 возвращает клеткам клопалъного варианта 8а чувствительность к действию egf (grudinkin etal., 2007) 85
4.3. Ингибирование тирозинкиназы рецептора egf и тирозинкиназ семейства src защищает клетки а431 от действия egf, а ингибирование мар-киназы р38 блокирует egf-индуцируемый апоптоз при сохранении блоков клеточного цикла (василенко и др., 200іб; grudinkin ет al., 2007) 86
4.4. Исследование роли транскрипционных факторов stat1 и stat3 в egf-индуцируемом апоптозе
Клеток а431 методом рнк-интерференции 88
4.4.1. Направленное снижение количества sta ті, но не sta тз, значительно уменьшает чувствительность клеток а431 к проапоптотическому действию egf (grudinkin et al, 2007) 89
4.4.2. В egf-зависимое накопление ингибитора циклин-зависимых киназ р2ґа/ и ингибитора апоптоза bcl-xl в клетках а431 вовлечен транскрипционный фактор stat3, по nestatl 91
Глава 5. Обсуждение 92
5.1. Индукция апоптоза и остановка клеточного цикла в клетках а431 при действии egf 92
5.2. Устойчивые к действию egf клональные варианты клеток а431 95
5.3. Действие ингибиторов киназ на клетки а431 97
5.4. Уменьшение экспрессии транскрипционных факторов семейства stat в клетках а431 методом рнк-интерференции 99
5.5. Предполагаемые механизмы индукции апоптоза при действии egf на клетки а431 101
Глава 6. Заключение 104
Выводы 105
Благодарности 106
Список работ, опубликованных по теме диссертации
