Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. Межвидовая ксенотрансплантация 8
1.2.Лечение нейродегенеративных заболеваний методом трансплантации... 14
1.3. Восстановительный потенциал центральной нервной системы и связанные с ним проблемы трансплантологии 21
1.3.1.Формирование глиального рубца и его влияние на регенерацию аксонов 21
1.3.2. Характеристика методов, направленных на улучшение восстановительных свойств ЦНС при повреждениях 23
1.4. Нейротрофические факторы (НФ) 27
1.4.1. Понятие и классификация нейротрофических факторов 31
1.4.2. Общая характеристика лигандов семейства GDNF(GFLs) 32
1.4.3. Характеристика рецепторов лигандов семейства GDNF 34
1.4.4. Индуцируемая GDNF RET-зависимая передача сигнала внутрь клетки 36
1.4.5. Индуцируемая GDNF RET-независимая передача сигнала внутрь клетки 37
1.4.6. Взаимодействие сигнального пути, индуцируемого GDNF, с сигнальными путями других факторов 40
1.4.7. Экспрессия и физиологические функции GDNF 42
1.4.8. Защитные и восстановительные свойства GDNF 44
1.4.9. Общая характеристика лигандов семейства NGF 47
1.4.10 Характеристика фактора роста нервов 48
1.4.11. Структура фактора роста нервов 52
1.4.12 Рецепторы NGF v -. 55
1.4.13. Сигнальные каскады, запускаемые NGF 59
1.4.14. BDNF как член семейства NGF 60
1.4.15. Внутриклеточные каскады, активируемые BDNF 62
1.4.16. Исследование мышей, нокаутированных по гену BDNF 64
1.4.17. Свойства BDNF, влияние на дифференцировку нейронов 65
1.4.18. Влияние нейротрофических факторов на поведение и память 67
1.4.19. Нейротрофические факторы при нейродегенеративных заболеваниях..69
1.5. Белки теплового шока (Hsp)
1.5.1. Классификация Hsp 73
1.5.2. Факторы индукции Hsp 76
1.5.3. Регуляция экспрессии белков семейств Hsp 78
1.5.4. Локализация и свойства Hsp 87
1.5.5. Hsp70 л-...ІІУ 88
1.5.6. Структурно-функционалный анализ белков семейства Hsp 70 89
1.5.7. Hsp и апоптоз 99
1.5.8. Стресс, адаптация и белки теплового шока 100
1.5.9. Перспективы использования системы Hsp в медицине 103
1.5.10. Экспрессия шаперонов в головном мозге 104
2. Материалы и методы 106
2.1. Методы 106
2.1.1. Рестрикция плазмидной ДНК 106
2.1.2. Электрофорез в агарозном геле 106
2.1.3. Выделение фрагментов ДНК из геля 106
2.1.4. Лигирование 107
2.1.5.Приготовление компетентных клеток 107
2.1.6. Трансформация компетентных клеток плазмидами 108
2.1.7. Выделение плазмидной ДНК из Е. coli в малом объеме 108
2.1.8. Выделение плазмидной ДНК из E.coli в большом объеме 109
2.1.9.Контроль наличия вставки (блот-гибридизация по Саузерну) ПО 2.1.10. Анализ ДНК-последовательности Ill
2.1.11.Конструкции 112
2.1.12.Метод инъекций 114
2.1.13. Выведение линий 114
2.1.14. Гибридизация in situ на целых эмбрионах 119
2.1.15. Очистка плазмид для введения в культуру клеток Млекопитающих... 121
2.1.16. Введение плазмиды в клетки линии НЕК293 при помощи ExGen 500 Transfection Reagent 121
2.1.17. Введение плазмиды в ЭСК мыши (линия R1) методом электропорации 122
2.1.18. Выделение суммарного препарата РНК 122
2.1.19. Проведение электрофореза РНК 123
2.1.20. Нозерн-блот гибридизация 123
2.1.21. Электрофорез в ПААГ...: 125
2.1.22. Вестерн-блот гибридизация 125
2.1.23. Культивирование клеток линии НЕК293 126
2.1.24. Получение мышиных эмбриональных фибробластов 126
2.1.25. Желатинизирование культуральныхчашек 127
2.1.26. Обработка МЭФ митомицином С 127
2.1.27. Культивирование ЭСК мыши линии R1 128
2.1.28. Проведение трансплантации 128
2.1.29. Получение срезов мозга 129
2.1.30. Иммуноцитохимический анализ 129
2.1.31. Количественная оценка величины глиального рубца 130
2.1.32. Ко-культивация фрагмента зачатка спинного мозга эмбриона человека с клетками трансгенной линии НЕК293, экспрессирующей gdnf 130
2.1.33. Получение первичной:культуры КлетоК В.те1апоаз1ег, трансгенных по гену ngf
2.2.1. Реактивы 131
2.2.2. Растворы, среды 132 і л t J)!
2.2.3. Вектора 139
2.2.4. Праймера 139
2.2.5. Антитела 139
2.2.6. Линии клеток 140
3. Результаты 140
3.1. Создание трансгенных линий Drosophila melanogaster гомозиготных по нейральному гену млекопитающих 140
3.2. Влияние экспрессии нейротрофического фактора на трансгенные клетки 140
3.3. Влияние экспрессии нейротрофического фактора на окружающие клетки при шжультивации 160
3.4. Влияние неироэктодермы трансгенных линий на окружающие клетки при ксенотрансплантации 170
3.5. Влияние белка теплового шока HSP70 дрозофилы на образование рубца при трансплантациях 180
3.6. Использование промоторно-регуляторной (п/р) области гена белка теплового шока дрозофилы (Hsp70), в качестве регуляторного элемента при введении чужеродных генов в клетки млекопитающих 184
3.7. Использование полученного вектора LP1, содержащего п/р область гена hsp70 дрозофилы .и маркерный ген gfp, в культурах клеток и в целых организмах : : 192
3.8. Получение конструкции для экспрессии ngf в клетках млекопитающих 199
3.9. Изучение влияния гиперэкспрессии ngf при ко-культивации
3.10. Получение конструкции для экспрессии gdnf в клетках млекопитающих 209
3.11. Исследование влияния гиперпродукции белка GDNF на трансгенные клетки 216
3.12. Изучение влияния гиперэкспрессии gdnf при ко-культивации 223
3.13. Изучение влияния гиперэкспрессии gdnfna образования глиальной
ткани при трансплантациях 224
4. Обсуждение результатов 229
Выводы 241
Список литературы
