Введение
1.1 Рак ободочной и прямой кишки 10
1.1.1 Генетические изменения при развитии рака ободочной и прямой кишки 10
1.1.2 Муцинозные опухоли толстого кишечника 12
1.2 Метилирование ДНК 14
1.2.1 Функция метилирования ДНК в прокариотах 14
1.2.2 Различия метилирования ДНК в эукариотах и прокариотах 15
1.2.3 Регуляция метилирования ДНК в эукариотических клетках 16
1.2.4 CpG островки 17
1.2.5 Регуляция экспрессии с помощью метилирования ДНК 19
1.3 Роль метилирования ДНК в канцерогенезе 20
1.3.1 Мутации метилированной ДНК 20
1.3.2 Снижение среднего уровня метилирования ДНК в опухолевых клетках 21
1.3.3 Региональное гиперметилирование в опухолях 22
2 Цели представленной работы 26
3 Материалы и методы 27
3.1 Образцы ткани 27
3.1.1 Подготовка срезов тканей для микродиссекции 27
3.1.2 Микродиссекция 27
3.2 Клеточные линии 27
3.3 Реактивы 28
3.3.1 Растворы и среды 28
3.3.2 Киты для молекулярной биологии 28
3.3.3 Рестрикционные ферменты 29
3.3.4 Модифицирующие ферменты 29
3.3.5 Праймеры и олигонуклеотиды 30
3.3.5.1 Праймеры для ПЦР 30
3.3.5.1.1 MUC2 кДНК 30
3.3.5.1.2 Промотор MUC2 30
3.3.5.1.3 Участок 1-го интрона гена MUC2 30
3.3.5.1.4 Последовательность промотора гена MUC2 обработанного бисульфитом 30
3.3.5.1.5 Мстилтрансфераза DNMT2 (Асе. Nr. AF045888) 31
3.3.5.1.6 Метилтрансфераза DNMT1 (Асе. Nr. Х63692) 31
3.3.5.1.7 p21waf(Acc.Nr.:U03106) 32
3.3.5.1.8 PDH (Асе. Nr. D90086) 32
3.3.5.2 Стандартные праймеры для реакции сиквенирования 32
3.3.5.3 Праймеры для однонулеотидной достройки праймера (SNuPE от Single Nucleotide Primer Extension) З З
3.3.6 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) З З
3.3.6.1 Анализ экспрессии MUC2 34
3.3.6.2 Амплификация участка промотора гена MUC2 34
3.3.6.3 Амплификация первого интрона гена MUC2 35
3.3.6.4 Амплификация обработанной бисульфитом ДНК из клеточных линий 35
3.3.6.5 Амплификация обработанной бисульфитом ДНК из срезов тканей 36
3.3.6.6 ПЦР для метилтрансферазы DNMT2 37
3.3.6.7 ПЦР для метилтрансферазы DNMT1 38
3.3.6.8 ПЦР обработанной бисульфитом плазмидной ДНК 38
3.3.6.9 Внесение мутаций в промотор MUC2 с помощью ПЦР 39
3.3.7 Зонды для Норзерн и Саузерн блот гибридизации 3 9
3.3.7.1 Анализ экспрессии гена MUC2 с помощью Норзерн блот гибридизации 39
3.3.7.2 Зонды для Саузерн блот гибридизации 39
3.3.7.3 Олигонуклеотид, содержащий первые 30 Ьр кДНК гена MUC2 40
3.3.7.4 18S рРНК 40
3.3.7.5 Проба для р21 40
3.3.7.6 Зонд для гена Люциферазы 40
3.3.8 Плазмидные вектора 41
3.3.9 Бактериальные штаммы 41
3.3.10 Геномная библиотека 41
3.4 Методы анализа фага Я. 41
3.4.1 Культура фага на чашках Петри 41
3.4.2 Определение титра фага 42
3.4.3 Скрининг фаговой библиотеки с помощью ПЦР 42
3.4.4 Приготовление фаговой суспензии с высоким титром 45
3.4.5 Выделение препаративных количеств ДНК фага лямбда 46
3.5 Выделение іиіазмид 47
3.5.1 Трансформация E.coli 47
3.5.2 Выделение аналитических количеств плазмидной ДНК 47
3.5.3 Выделение препаративных количеств плазмидной ДНК 48
3.5.4 Выделение фрагментов ДНК из агарозных гелей 48
3.5.5 Конструирование плазмид 48
3.5.6 Клонирование продукта ПЦР в вектор ТОРО ТА 49
3.6 Анализ экспрессии генов 49
3.6.1 Выделение тотальной РНК 49
3.6.2 Норзерн блот гибридизация 49
3.6.2.1 Приготовление геля 49
3.6.2.2 Перенос РНК на мембрану 50
3.6.2.3 Мечение зондов 50
3.6.2.4 Гибридизация мембран 50
3.6.3 Обратная транскрипция-ПЦР (RT-ПЦР) 51
3.6.3.1 Синтез кДНК 51
3.7 Анализ метилирования ДНК 52
3.7.1 Саузерн блот гибридизация 52
3.7.2 Анализ метилирования ДНК с помощью бисульфитного сиквенирования 53
3.7.3 Анализ метилирования при помощи SNuPE 54
3.7.4 Ингибирование метилирования 5-аза-2-деоксицитидином 56
3.8 Репортерный анализ активности промотора 56
3.8.1 Метилирование ДНК in vitro 56
3.8.2 Трансфекция эукариотических клеток 56
3.8.3 Определение активности люциферазы и р-галактозидазы 57
3.8.4 Нормализация эффективности трансфекции при помощи дот блот гибридизации 57
4 Результаты 58
4.1 Выделение и анализ промотора гена MUC2 58
4.1.1 Получение клона фага лямбда содержащего 5участок гена MUC2 58
4.1.2 Сиквенирование и анализ промотора 64
4.1.3 Анализ регуляции промотора MUC2 66
4.2 Метилирование промотора в различных клеточных линиях 71
4.2.1 Метилирование промотора MUC2 в клетках экспрессирующих и не экспрессирующих MUC2 71
4.2.2 Анализ метилирования промотора MUC2 бисульфитным сиквенированием 74
4.2.3 Подавление метилирования приводит к активации MUC2 77
4.3 Метилирование промотора MUC2 в клонированных клетках 78
4.3.1 Подавление метилирования и получение клонов 78
4.3.2 Метилирование промотора MUC2 в полученных клонах 81
4.3.3 Изменения экспрессии генов в клонах 84
4.4 Влияние сайт-специфичного метилирования на активность промотора 86
4.4.1 Влияние метилирования на активность промотора в различных клеточных линиях 86
4.4.2 Анализ мутаций цитозинов в CpG сайтах #5 и #8 88
4.4.3 Анализ потенциального de novo метилирования или деметилирования трансфецированной плазмиды -89
4.5 Метилирование промотора MUC2 в тканях 90
4.5.1 Использование микродиссекции 90
4.5.2 Анализ метилирования промотора MUC2 в тканях 90
4.5.3 Метилирование промотора MUC2 в бокаловидных клетках 92
5 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 94
5.1 Анализ последовательности промотора MUC2 94
5.2 Регуляция экспрессии MUC2 в клеточных линиях 95
5.3 Регуляция экспрессии MUC2 в нормальной и опухолевой тканях 99
5.4 Роль метилирования при развитии муцинозных карцином 102
6 Список литературы
