Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Биохимические аспекты процессов, ведущих к интенсификации глюконеогенеза 12
1.2. Особенности обмена жирных кислот и гликогена у позвоночных животных 17
1.2.1. Биохимические сведения о трансформации жирных кислот в углеводы 23
1.2.2. Роль и регуляция активности глюконеогенетических ферментов при голодании 26
1.3. Роль глюконеогенеза в онтогенезе некоторых видов беспозвоночных.
1.4. Глиоксилатный цикл как промежуточный этап глюконеогенеза 33
1.4.1. Распространение глиоксилатного цикла у грибов бактерий и низших водорослей 34
1.4.2. Глиоксилатный цикл высших растений 38
1.4.3. Глиоксилатный цикл в тканях животных 40
1.4.4. Индукция глиоксилатного цикла в патогенах 44
1.5. Характеристика ключевых ферментов глиоксилатного цикла... 47
1.5.1. Физико-химические свойства ИЦЛ 49
1.5.2. Кинетические и регуляториые характеристики ИЦЛ 52
1.5.3. Характеристика структуры гена и пространственной организации изоцитратлиазы и малатсинтазы 54
1.6. Эволюция ферментов глиоксилатного цикла...62
1.7. Экспрессия и регуляция работы глиоксилатного цикла 68
Экспериментальная часть
2.1. Цель и задачи74
2.2. Объекты и методы исследования 74
2.2.1. Объекты исследования...74
2.2.2. Методы исследования...75
2.2.2.1. Создание условий пищевой депривации для крыс Rattus Rattus 75
2.2.2.2. Выращивание бабочки P.machaon L 75
2.2.2.3. Выращивание культур бактериальных клеток 75
2.2.2.4. Получение экстрактов различных тканей 76
2.2.2.5. Дифференциальное центрифугирование 76
2.2.2.6. Определение активности ферментов 76
2.2.2.7. Определение концентрации метаболитов углеводного обмена...78
2.2.2.8. Определение количества белка 79
2.2.2.9. Выделение и очистка ферментов 79
2.2.2.10. Фракционирование белков с помощью сульфата аммония 80
2.2.2.11. Гель-фильтрация и ионообменная хроматография 80
2.2.2.12. Определение молекулярной массы нативного фермента 81
2.2.2.13. Электрофоретические исследования.. 81
2.2.2.14. Определение массы субъединиц фермента 82
2.2.2.15. Исследование кинетических характеристик и регуляции активности ферментов 82
2.2.2.16. Экстракция суммарной РНК 83
2.2.2.17. Выделение ДНК 83
2.2.2.18. Проведение обратной транскрипции мРНК и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР)... 84
2.2.2.19. Проведение Саузерн-дот-блоттинга 85
2.2.2.20. Определение количества РНК и ДНК 86
2.2.2.21. Анализ аминокислотных и нуклеотидных последовательностей..86
2.2.2.22. Аналитический электрофорез нуклеиновых кислот в агарозном геле... 86
2.2.2.23. Препаративный электрофорез ПЦР-продукта в агарозном геле..87
2.2.2.24. Эктракция ДНК из агарозного геля... 87
2.2.2.25. Клонирование ампликона в прокариотической системе...87
2.2.2.26. Выделение плазмидной ДНК из Escherichia colu 88
2.2.2.27. Секвенированиє ДНК. 89
2.2.2.28. Статистическая обработка данных 89
2.3. Полученные результаты и их обсуждение 90
2.3.1. Динамика содержания основных субстратов и метаболитов в ходе онтогенеза у бабочки P.machaon и печени контрольных и голодающих крыс 90
2.3.1.1. Изменение концентрации некоторых метаболитов у бабочки махаона 90
2.3.1.2. Изменение концентрации некоторых метаболитов в печени контрольных и голодающих крыс 93
2.3.2. Динамика активности ферментов углеводного метаболизма в ходе онтогенеза у бабочки P.machaon и у крыс при пищевой депривации...96
2.3.2.1. Динамика активности ФЕПКК в ходе онтогенеза бабочки махаона и в печени и почках голодающих крыс 104
2.3.2.2. Сравнение активностей ИЦЛ у организмов различных таксономических груп... 107
2.3.3. Очистка ИЦЛ из куколок махаона и печени голодающих крыс 110
2.3.3.1. Очистка ИЦЛ из куколок бабочки P.machaon... 110
2.3.3.2. Очистка ИЦЛ из печени голодающих крыс 114
2.3.3.3. Очистка ФЕПКК из печени голодающих крыс 114
2.3.3.4. Изучение кинетических, физико-химических и регуляторных характеристик ИЦЛ из куколок бабочки P.machaon 118
2.3.3.5. Изучение кинетических, физико-химических и регуляторных характеристик ИЦЛ из печени голодающих крыс 128
2.3.3.6. Сравнение свойств ИЦЛ из бабочки махаона и печени крыс 138
2.3.4. Характеристика экспрессии ИЦЛ в куколках бабочки махаона и в печени голодающих крыс. ...138
2.3.4.1. Анализ нуклеотидных последовательностей и разработка праймеров для идентификации гена изоцитратлиазы и малатсинтазы...144
2.3.4.2. Оптимизация условий и проведение ПЦР для обнаружения генов МС и ИЦЛ в геномах различных таксономических групп 146
2.3.4.3. Подбор условий и оптимизация метода Саузерн-блоттинг для характеристики экспрессии ИЦЛ в куколках бабочки P.machaon 153
2.3.4.4. Клонирование и сиквеис участка гена ИЦЛ из бабочки P.machaon 155
Заключение 158
Выводы. 164
Литература 166
