Введение
Глава 1. Обзор литературы 15
1.1. Физиологическая роль NO у животных 16
1.2. Образование и утилизация NO в клетках растений 19
1.3. Физиологическая роль NO у растений
1.3.1. Методы определения NO и его производных 28
1.3.2. Экзогенные доноры NO, применяемые в экспериментах с объектами растительного происхождения 33
1.4. Молекулярные механизмы действия NO 35
1.5. Взаимодействие NO и фитогормонов. 40
1.6. Путь передачи сигнала этилена 45
1.6.1. Рецепторы этилена у растений A. thaliana 45
1.6.2. Белки, функционирующие на пост-рецепторном уровне в пути передачи этиленового сигнала
1.6.2.1. Белок CTR1 – негативный регулятор пути передачи сигнала этилена 47
1.6.2.2. Белок EIN2 – позитивный регулятор пути передачи этиленового сигнала 49
1.6.3. Участие этилен-зависимых МАРК в передаче сигнала этилена 51
1.6.3.1. Организация и основные принципы работы MAPK каскадов 52
1.6.3.2. Роль белка CTR1 – киназы Raf-типа в пути передачи сигнала этилена 55
1.7. Клеточный цикл – мишень действия NO 58
1.7.1. Основные белковые регуляторы клеточного цикла у растений 58
1.7.2. Действие NO на клеточный цикл у животных 62
1.7.3. Действие NO на клеточный цикл у растений 65
Глава 2. Объекты и методы исследования
2.1. Объект исследования 70
2.2. Обработка суспензионных культур Col-0 и ein2-1 донором NO 71
2.3. Определение накопления активных форм азота (АФА) и АФК культивируемыми клетками Col-0 и ein2-1 72
2.4. Определение жизнеспособности культивируемых клеток Col-0 и ein2-1, обработанных донором NO 73
2.5. Определение доли клеток Col-0 и ein2-1, находящихся в S-фазе клеточного цикла, и оценка распределения ядер по плоидности 73
2.6. Флуоресцентная микроскопия 74
2.7. Определение продукции этилена клетками Col-0 и ein2-1 76
2.8. ПЦР после обратной транскрипции (ОТ-ПЦР) 76
2.9. Выделение белков из культивируемых клеток Col-0 и ein2-1
2.10. Фосфорилирование цитозольных белков in vitro 78
2.11. Определение МАРК активности in vitro 79
2.12. Электрофорез белков в денатурирующих условиях 79
2.13. Двумерный электрофорез (2-DЕ) белков 79
2.14. Полусухой перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану (вестерн-блоттинг) 80
2.15. Получение и очистка рекомбинантных белков 81
2.16. Нитрирование рекомбинантных белков 85
2.17. S-нитрозилирование рекомбинантных белков 85
2.18. Окраска полиакриламидных гелей
2.18.1. Окраска гелей коллоидным Кумасси СВВ G-250 86
2.18.2. Окраска гелей Кумасси СВВ R-250 86
2.19. Статистическая обработка данных 86
Глава 3. Результаты и их обсуждение 87
3.1. Влияние SNP на жизнеспособность, накопление NO и АФК культивируемыми клетками Col-0 и ein2-1 87
3.2. Накопление NO в клетках Col-0 и ein2-1 в ходе периода субкультивирования 97
3.3. Влияние SNP на выделение этилена культивируемыми клетками Col-0 и ein2-1 101
3.4. Влияние NO на прохождение клеточного цикла культивируемыми клетками Col-0 и ein2-1 104
3.5. Влияние SNP на фосфорилирование белков, выделенных из культивируемых клеток Col-0 и ein2-1 113
3.6. Влияние NO-зависимых посттрансляционных модификаций на
энзиматическую активность рекомбинантных МАРКК и МАРК 128
Заключение 143
Выводы 152
Список литературы
