ВВЕДЕНИЕ............................................................................................................................................ 5
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ............................................................................................................. 12
1.1. Ядрышко: функции, морфология и динамика............................................................. 12
1.2. Рибосомные гены эукариот.............................................................................................. 15
1.3. Поддержание стабильности рибосомного кластера .................................................... 17
1.4. Синтез и процессинг рибосомной РНК.......................................................................... 19
1.4.1. Инициация транскрипции рибосомной ДНК ................................................................ 20
1.4.2. Элонгация транскрипции рибосомной ДНК ................................................................. 24
1.4.3. Терминация транскрипции рибосомной ДНК............................................................... 25
1.4.4. Основные этапы процессинга рибосомной РНК........................................................... 26
1.5. Дифференциальная экспрессия рибосомных генов .................................................... 29
1.5.1. Анализ рибонуклеопротеиновых комплексов по Миллеру ......................................... 30
1.5.2. Различия плотности нуклеосомной упаковки генов рибосомной РНК ...................... 32
1.5.3. Уровень метилирования и наличие маркеров эу- и гетерохроматина в повторах
рибосомной ДНК.......................................................................................................................... 33
1.5.4. Дифференциальная репликация генов рибосомной РНК............................................. 37
1.5.5. Экспрессия генов рибосомной РНК, содержащих полиморфизмы ............................ 38
1.5.6. Анализ экспрессии рибосомной ДНК методами микроскопии сверхвысокого
разрешения.................................................................................................................................... 39
1.5.7. Феномен ядрышкового доминирования ........................................................................ 40
1.6. Ядрышковые ретротранспозоны и контроль их экспрессии.................................... 41
1.6.1. Транспозоны в геноме Drosophila melanogaster и способы их репрессии ................. 41
1.6.2. Структура ядрышковых транспозонов и их интеграция в геном хозяина.................. 43
1.6.3. Регуляция экспрессии ядрышковых ретротранспозонов ............................................. 44
1.7. Сумоилирование и его связь с рибосомными генами................................................. 46
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..................................................................................................... 49
2.1. Трансгенные и мутантные линии Drosophila melanogaster........................................ 49
2.2. Короткие олигонуклеотиды (праймеры)....................................................................... 52
2.3. Работа с культурой клеток насекомых.......................................................................... 52
2.3.1. Культивирование и работа с клеточными линиями...................................................... 52
3
2.3.2. Нокдаун генов в культуре клеток S2.............................................................................. 53
2.4. Выделение и анализ нуклеиновых кислот .................................................................... 53
2.4.1. Выделение РНК методом гуанидинтиоцианатной экстракции ................................... 53
2.4.2. Обратная транскрипция................................................................................................... 54
2.4.3. Выделение ДНК из клеток и тканей Drosophila melanogaster..................................... 54
2.4.4. Полимеразная цепная реакция ........................................................................................ 55
2.4.5. Количественная ПЦР в реальном времени .................................................................... 55
2.4.6. Анализ нуклеиновых кислот с помощью гель-электрофореза .................................... 56
2.5. Иммунопреципитация хроматина .................................................................................. 56
2.6. Иммуноокрашивание яичников Drosophila melanogaster........................................... 57
2.7. Флуоресцентная гибридизация одиночных молекул РНК ........................................ 58
2.8. Обработка и визуализация данных ................................................................................ 59
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ......................................................................................... 60
3.1. Роль сумоилирования в подавлении экспрессии ядрышковых
ретротранспозонов ......................................................................................................................... 60
3.1.1. Компоненты системы сумоилирования необходимы для подавления экспрессии
генов рРНК с инсерциями R1 и R2............................................................................................. 60
3.1.2. Нарушение процесса сумоилирования приводит к активации транскрипции генов
рРНК, содержащих вставки различных МЭ.............................................................................. 66
3.1.3. SUMO-зависимая репрессия рДНК предотвращает связывание РНК-полимеразы I с
генами рРНК................................................................................................................................. 70
3.1.4. Нокдауны ряда белков, ассоциированных с ядрышком и рДНК, приводят к активации
экспрессии генов рРНК с инсерциями R1 и R2......................................................................... 74
3.2. Нарушение инициаторного комплекса SL1-like приводит к усилению экспрессии
генов рРНК с инсерциями ретротранспозонов ........................................................................ 76
3.2.1. Мутации гена, кодирующего белок Udd, приводят к активации R1 и R2.................. 76
3.2.2. Транскрипты R2 накапливаются преимущественно в герминальных клетках
яичников на фоне мутаций udd................................................................................................... 80
3.2.3. Нарушение любых компонентов комплекса SL1-like приводит к активации
транскрипции ядрышковых ретротранспозонов в яичниках Drosophila................................ 81
3.3. Роль гетерохроматина в подавлении экспрессии ядрышковых
ретротранспозонов ......................................................................................................................... 83
4
3.3.1. Гены рРНК с инсерциями обогащены маркерами гетерохроматина .......................... 83
3.3.2. Нарушение формирования гетерохроматина приводит к частичной дерепрессии
ядрышковых ретротранспозонов ................................................................................................ 85
3.3.3. Уровень маркера гетерохроматина H3K9me3 на генах уменьшается при активации
транскрипции рРНК..................................................................................................................... 88
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.................................................................................................................................. 90
ВЫВОДЫ............................................................................................................................................. 92
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ................................................ 93
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ................................................................................................................ 99
Приложение А................................................................................................................................... 138
Приложение Б ................................................................................................................................... 145
Приложение В ................................................................................................................................... 149
Приложение Г ................................................................................................................................... 153
