Введение
1. Обзор литературы 12
1.1. Биологические и морфологические особенности эхинококка 12
1.2. Антигенный состав эхинококка 13
1.3. Иммодиагностика ларвального гидатидоза 16
1.4. Особенности строения генома эхинококка 22
1.5. Использование методов молекулярной биологии для оптимизации экспрессии клонированных генов 25
1.5.1. Амплификация генов в составе рекомбинантных плазмид 25
1.5.2. Конструирование "генов гибридных белков" как метод оптимизации трансляции 28
1.5.3. Стабилизация мРНК чужеродного гена 29
1.5.4. Стабилизация чужеродных белков в E.coli 30
1.5.5. Применение методов генной инженерии в гельминтологии 34
1.5.6. Генно-инженерные антигены в диагностике и вакцинопрофилактике цистных гидатидозов 35
2.Собственные исследования... 39
2.1. Материалы 39
2.2. Используемые реактивы 40
2.3. Методы исследований 40
2.3.1. Выделение геномной ДНК Е.granulosus из протосколексов паразита 40
2.3.2. Выделение ДНК векторного бактериофага Xgtll 41
2.3.3. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции 42
2.3.4. Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК в агарозном геле..44
2.3.5. Получение препаративных количеств ДНК векторной плазмиды 44
2.3.6. Проведение ДНК-ДНК гибридизации 46
2.3.7. Амплификация гомологичных фрагментов из генома эхинококка синтезированными олигонуклеотидньши праймерами , 46
2.3.8. Лигирование плазмидной векторной ДНК с фрагментом эукариотического гена 47
2.3.9. Проведение реакции трансформации 47
2.3.10. Скрининг рекомбинантных клонов 48
2.3.11. Экспрессия гибридного белка рекомбинантной плазмидой 49
2.3.12. Электрофорез в денатурирующих условиях 49
2.3.13. Электроперенос 52
2.3.14. Постановка иммуноферментной реакции 53
2.3.15. Иммунное выявление антигенов на фильтре 54
2.3.16. Изучение протективных свойств рекомбинантного антигена EgF 55
3. Результаты исследований 57
3.1. Наработка препаративных количеств ДНК Echinococcus granulosus для создания банка генов паразита 57
3.1.1.Создание и амплификация библиотеки Е.granulosus в фаге Xgtll 57
3.1.2. Элюция фрагмента кДНК эхинококка из геля легкоплавкой агарозы.. 61
3.1.3. Клонирование фрагмента гена Е. granulosus EgF в векторной системе фаг-клетки E.coliY-1088, Y-1090 65
3.1.4. Проведение ДНК-ДНК гибридизации 66
3.1.5. Особенности экспрессии рекомбинантых белков в векторной системе Xgtll/EgF-iaieTKHExoliY1089 69
3.1.6. Анализ рекомбинантных белков, синтезированных в векторной системе клетки E.coli штамма Y 1089-рекомбинантныйфагЯзШ/Р 69
3.1.7. Иммунологический анализ рекомбинантных белков, получаемых в векторной системе на основе рекомбинантного фага Xgtll/EgF методом Western-blot анализа 72
3.1.8. Синтез генно-инженерных белков в векторной системе на основе рекомбинантного фага Xgt 11 /EgF 72
3.1.9. Переклонирование фрагмента кДНК эхинококка в плазмидные векторные системы 74
3.1.10. Определение нуклеотидной и аминокислотной последовательности клонированного фрагмента EgF 78
3.1.11. Конструирование рекомбинантных плазмид EgF с использованием векторов семейства pGEX и pQE 81
3.1.12. Векторы семейства pGEX 82
3.1.13. Клонирование фрагмента гена EgF E.granulosus в плазмидной векторной системе pQE/SQ 13009 83
3.1.14. Использование ПЦР при получении фрагментов генов, кодирующих антигены эхинококка для оптимизации создания плазмидных векторных систем 86
3.1.15. Создание продуцента рекомбинантных белков в векторной системе плазмида pQE - клетки Е. coli SQ-13009 87
3.1.16. Протективная эффективность рекомбинантного антигена EgF 100
Обсуждение полученных результатов 103
Выводы .117
Практические предложения 119
Список литературы 120
Приложение 135
