Введение
Обзор литературы 11
Механизм агрегации белков 11
Естественно развернутые белки 14
Агрегация, как причина прионных заболеваний 23
Структура и свойства казеинов 39
aSl-казеин х82-казеин 41
р-Казеин 42
к-Казеин 44
Образование мицелл 48
Гомоцистеинилирование как физиологическая посттрансляционная модификация белков 50
Гомоцистеин, его свойства и метаболические превращения в клетке... 50
Гипергомоцистеинемия и ее роль в патологических процессах 51
Пути гомоцистеинилирования белков 53
Материалы и методы 59
Материалы 59
Получение разных форм приона 59
Экспрессия 59
Очистка 60
Экстракция 60
Аффинная хроматография 61
Хранение 62 Термоагрегация приона 62
Агрегация приона при взаимодействии с фосфатидилинозитолом 62
Гомоцистеинилирование приона 62
Получение разных форм казенное 63
Разделение нативных aSl, р, к-казеинов молока с помощью анионобменной хроматографии 63
Получение разных форм рекомбинантного Р-казеина 63
Экспрессия рекомбинантного Р-казеина 63
Очистка 64
Экстракция белков 64
Хроматографическая очистка 65
1) Обратнофазовая хроматография 65
2) Анионобменная хроматография 66
3) Повторная обратнофазовая хроматография 66
Димеризация мутантных форм рекомбинантного р-казеина 61
Протеолиз пепсином и трипсином 67
Гомоцистеинилирование нативных казеинов 68
Методы исследования структуры белков и их агрегатов 69
ДСН-электрофорез в полиакриламидном геле 69
Гель-фильтрация 69
Метод динамического лазерного светорассеяния (ДЛС) 70
Круговой дихроизм 70
Инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье (ИК спектроскопия) 71 Флуоресцентная спектроскопия 73
Абсорбционная спектроскопия с Конго красным для выявления амилоидов 75
Количественный анализ включения гомоцисгеина с помощью метода определения SH-групп по Эллману 76
Масс-спектрометрия методом ионизации в элсктроспрее 77
Масс-спектрометрия MALDI TOF 77
Электронная микроскопия 78
Атомно-силовая микроскопия 79
Флуоресцентная микроскопия 79
Расщепление протеиназой К 80
Результаты и их обсуждение 81
Изучение агрегации казенное. 81
Получение препаратов: 81
а) разделение казеинов молока 81
б) получение и очистка цистеинилированных мутантов 83
Масс-спектрометрия 88
Исследование свойств мутантов 90
Димеризация N- и С-концевых мутантов казеина 90
Мультимеризация двойного мутанта С4-208 95
методом ДЛС 97
Изучение влияния димеризации и мицеллизации на вторичную структуру казеина методом кругового дихроизма (КД) 99
Протеолиз трипсином 104
Расщепление пепсином 108
Гомоцистеинилирование нашивных казеинов молока 113
Характеристика использованных препаратов казеина 114
Изменение агрегационного состояния казеинов после гомоцистеинилирования 117
Количественное определение содержания остатков гомоцистеина в препаратах р-казеина 124
Измерение собственной триптофановой флуоресценции и использование флуоресцентных зондов для выявления структурных изменений казеинов при гомоцистеинилировании 125
Флуоресценция ANS 132
Взаимодействие казеинов с красителем Конго Красным 134
Изучение морфологии гомоцистеинилированных агрегатов казеинов с помощью флуоресцентной микроскопии 136
Трансмиссионная электронная микроскопия гомоцистеинилированных казеинов 137
Изучение агрегации приона 150
Получение и выделение рекомбинантного овечьего приона 150
Исследование термоагрегации приона, получение и характеріаация свойств малых патологических олигомеров 152
Электронная микроскопия агрегатов приона 157
Исследование влияния липидов на амилоидогенную конверсию 160
Размер прион-липидных агрегатов 161
Вторичная структура агрегатов приона 164 Исследование амилоидогенной конверсии, вызванной
гомоцистеинилировапием 171
Подтверждение и качественное определение модификации 171
Количественный анализ эффективности включения гомоцистеина в прион 173
Анализ наличия гомоцистеина в составе модифицированного приона методом масс-спектрометрии 175
Агрегация приона в процессе гомоцистеинилирования 179
Изучение изменений во вторичной структуре гомоцистеинилированного приона 181
Амилоидогенная конверсия модифицированного приона 183
Повышение устойчивости гомоцистеинилированного приона к действию протеиназыК 185
Морфология агрегатов гомоцистенилированного приона 185
Трансмиссионная электронная микроскопия гомоцистеинилированного приона 187
Роль некоторых лизинов приона в обеспечении устойчивости его структуры 189
Выводы 193
Список литературы
