Введение
2. Обзор литературы 14
2.1. Трансформация клеток 14
2.2. Ras/Raf/MEK/ERK-каскад 17
2.2.1. Ras/Raf/MEK/ERK-сигнальный каскад, его функции и другие MAP-каскады 17
2.2.2. Ras и его мишени в опухолевой трансформации 19
2.3. Аутофагия 21
2.3.3. Стадии аутофагии и их регуляция 21
2.3.2. Митофагия 25
2.3.3. Роль аутофагии в злокачественной трансформации клеток 26
2.3.4. Аутофагия в ответе на любое воздействие на клетку 28
2.4. mTOR-киназа, ее функции и роль в злокачественной трансформации 30
2.4.1. Структура и функции mTOR 30
2.4.2. Применение ингибиторов mTOR-киназы в противоопухолевой терапии 34
2.5. Клеточное старение, его регуляция и роль в норме и в канцерогенезе 35
2.5.1. Особенности пространственной организации старых клеток 36
2.5.2. Взаимоотношение процессов аутофагии и старения 40
2.6. Типы клеточной гибели. 41
2.6.1. Апоптоз 42
2.6.2 Взаимоотношения аутофагической гибели и апоптоза 44
3. Материалы и методы 47
3.1. Материалы 47
3.1.1. Клеточные линии 47
3.1.2. Ингибиторы 47
3.1.3. Антитела 48
3.2. Методы 50
3.2.1. Трансфекция клеток 50
3.2.2. Оценка жизнеспособности клеток с помощью МТТ-теста 50
3.2.3. Оценка пролиферативной активности клеток 50
3.2.4. Оценка клоногенной выживаемости клеток 51
3.2.5. Проточная цитометрия 51
3.2.6. Иммунофлуоресценция 51
3.2.7. Анализ морфологии клеток 52
3.2.8. Вестерн-блоттинг 52
3.2.9. Анализ фрагментации ДНК методом электрофореза в агарозном геле 53
3.2.10. Анализ активности каспаз 53
3.2.11. Анализ активности протеасом 54
3.2.12. Оценка целостности митохондрий 54
3.2.13. Измерение количества активных форм кислорода (АФК) 54
3.2.14. Измерение уровня лактата в среде культивирования 55
3.2.15. Анализ активности лизосом с помощью Lysotracker Green 55
3.2.16. Трансмиссионная электронная микроскопия 55
3.2.17. Анализ ассоциированной со старением бета-галактозидазы 55
3.2.18. Измерение содержания белка в клетках 55
3.2.19. Оценка размера клеток 56
3.2.20. Анализ активности лизосомальной бета-галактозидазы 56
3.2.21. Статистическая обработка 56
4. Результаты 57
4.1. Трансформанты ERas восстанавливают жизнеспособность при ингибировании MEK/ERK-пути за счет активации цитопротективной АМРК-зависимой аутофагии . 57
4.2. Стареющие клетки не способны завершать аутофагию в ответ на ингибирование MEK/ERK-пути и гибнут апоптозом . 70
4.2. Нарушение терминации аутофагии в стареющих клетках при ингибировании MEK/ERK-пути связано с пространственным разобщением аутофагосом и лизосом в цитоплазме 88
4.3. Ингибирование MEK/ERK-пути в стареющих клетках приводит к релокализации онкогенного Ras с цитоплазматической мембраны в цитозоль, что может блокировать его анти-апоптотические функции 90
4.5 Комбинация индуктора старения и ингибитора MEK/ERK снижает жизнеспособность Bcl2-оверэкспрессирующих клеток 92
4.6. Подавление активности mTORC1 не приводит к восстановлению AMPK зависимой аутофагии и жизнеспособности стареющих клеток при ингибировании MEK/ERK-пути 95
4.7. MEK/ERK-путь необходим для активации аутофагии в ответ на ДНК-повреждение, вызванное облучением 108
4.8. Индукция старения делает KRas-экспрессирующие клетки человека А549 чувствительными к киназному ингибитору MEK/ERK-пути. 113
5. Обсуждение 116
6. Заключение и выводы 125
6.1. Заключение 125
6.2. Выводы 126
7. Список литературы 127
Благодарности 149
