Введение
2. Обзор литературы 10
2.1. Концепция стресса 10
2.2. Феномен ИТ 13
2.3. Классификация и основные классы БТШ 15
2.4.1. Белки семейства БТШ 100 (HsplOO/Clp) 18
2.4.2. Белки семейства БТШ90 (Hsp90) 29
2.4.3. Белки семейства БТШ70 (Hsp70) 30
2.4.4. Шаперонины (семейство БТШ60 (Hsp60)) 34
2.4.5. Низкомолекулярные БТШ (sHsps) 35
2.5. Причины и механизмы гибели клетки при стрессе 37
2.5.1. Некроз и апоптоз: сходства и различия (обзор возможных форм гибели клетки) 38
2.5.2. Признаки ПКГ 43
2.5.3. Механизм апоптоза у животных клеток. Сходства и различия с ПКГ дрожжевой и растительной клеток 44
2.6. Роль митохондрии в развитии ПКГ 48
2.7. БТШ как регуляторы апоптоза на примере животной клетки 51
2.8. Сведения о роли растительных и дрожжевых БТШ в развитии ПКГ 53-
3. Материалы и методы 55
3.1. Объект исследования 55
3.2. Температурная обработка 55
3.3. Определение выживаемости клеток 56 -
3.4. Определение дыхательной активности 58
3.5. Выделение суммарного белка 58
3.6. Получение цитоплазматической и митохондриальной белковых фракций 59
3.7. Электрофорез в ПААГе с ДДС-Na 63
3.8. Окраска и обесцвечивание гелей 64
3.9. Вестерн-блотинг 64
ЗЛО. Определение молекулярных масс полипептидов 65
3.11. Использованные антитела 65
3.12. Выделение ДНК 65
3.13. Микроскопические методы (флуоресцентная и световая микроскопия) 66
3.14. Статистическая обработка данных 68
4. Результаты 69
4.1. Изучение зависимости между гибелью клеток и синтезом БТШ 69
4.1.1. Изучение зависимости между гибелью клеток и синтезом БТШ у суспензионной культуры A. thaliana 69
4.1.2. Изучение зависимости между гибелью клеток и синтезом БТШ в культуре дрожжей & cerevisiae 72
4.2. Изучение зависимости между синтезом БТШ и развитием ИТ 73
4.2.1. Изучение зависимости между синтезом БТШ и развитием ИТ у суспензионной культуры^, thaliana 73
4.2.2. Изучение зависимости между синтезом БТШ и развитием ИТ у культуры дрожжей S. cerevisiae 76
4.3. Параметры гибели клеток при тепловом шоке 77
4.3.1. Изменение морфологии клеток 77
4.3.1.1. Изменение морфологии клеток суспензионной культуры A. thaliana после теплового шока 77
4.3.1.2. Изменение морфологии клеток в культуре дрожжей S. cerevisiae после теплового шока 79
4.3.2. Изучение динамики движения цитоплазмы с помощью цейтраферной съёмки 81
4.3.2.1. Изучение движения цитоплазмы после тепловых воздействий у суспензионной культуры A. thaliana 81
4.3.2.2. Изучение движения цитоплазмы после тепловых воздействий в культуре дрожжей S. cerevisiae 82
4.3.3. Изучение динамики гибели клеток 82
4.3.3.1. Динамика гибели клеток у суспензионной культуры A. thaliana после теплового шока 83
4.3.3.2. Динамика гибели дрожжей 5". cerevisiae после теплового шока 88
4.3.4. Высвобождение цитохрома с 92
4.3.5. Изучение состояния плазматической мембраны у дрожжей S. cerevisiae после теплового шока 93
4.3.6. Качественное измерение электрохимического потенциала на ВММ в живых клетках с помощью флуоресцентной микроскопии 94
4.3.6.1 Изучение изменения электрохимического потенциала на ВММ у клеток суспензионной культуры^, thaliana при гипертермии 94
4.3.6.2. Изучение изменения электрохимического потенциала на ВММ у клеток дрожжей S. cerevisiae при гипертермии 97
4.3.7. Качественное измерение продукции АФК в живых клетках с помощью флуоресцентной микроскопии 98
4.3.7.1. Изучение продукции АФК во время гипертермии у суспензионной культуры A. thaliana 98
4.3.7.2. Изучение продукции АФК во время гипертермии у дрожжей S. cerevisiae.99
4.3.8. Морфология ядер 100
4.3.8.1. Изучение морфологии ядер у суспензионной культуры A. thaliana после теплового шока 100
4.3.8.2. Изучение морфологии ядер у дрожжей S. cerevisiae после теплового шока 102
4.4. Изучение распределения БТШ между митохондриальной и цитоплазматпческой фракциями белков после воздействия повышенной температурой 103
4.4.1. Распределение БТШ между митохондриальной и цитоплазматической фракциями белков после тепловых воздействий у суспензионной культуры A. thaliana 104
4.4.2. Распределение БТШ между митохондриальной и цитоплазматической фракциями белков после тепловых воздействий у дрожжей S. cerevisiae 105
4.4.3. Распределение HsplOl и Hspl7,6 между митохондриальной и
цитоплазматической фракциями белков у суспензионной культуры A. thaliana с конститутивной экспрессией HSP101 в контроле и после мягкого теплового стресса 107
4.5. Влияние мягкой тепловой предобработки на развитие параметров гибели клеток 109
4.5.1. Влияние мягкой тепловой предобработки на морфологию клеток 109
4.5.1.1. Влияние мягкой тепловой предобработки на морфологию клеток у суспензионной культуры^!, thaliana после теплового шока 109
4.5.1.2. Влияние мягкой тепловой предобработки на морфологию клеток у дрожжей S. cerevisiae после теплового шока ПО
4.5.2. Влияние мягкой тепловой предобработки на остановку движения цитоплазмы после теплового шока 111
4.5,2.1. Влияние мягкой тепловой предобработки на остановку движения цитоплазмы после теплового шока у суспензионной культуры A thaliana 111
4.5.2.1. Влияние мягкой тепловой предобработки на остановку движения цитоплазмы после теплового шока у дрожжей S. cerevisiae ИЗ
4.5.3. Влияние мягкой тепловой предобработки на распределение белков между митохондриальной и цитоплазматической фракциями белков 113
4.5.3.1. Влияние мягкой тепловой предобработки на распределение белков между митохондриальной и цитоплазматической фракциями у суспензионной культура А. thaliana после теплового шока при 50С 113
4.5.3.2. Влияние мягкой тепловой предобработки на распределение белков между митохондриальной и цитоплазматической фракциями у дрожжей & cerevisiae после теплового шока при 45С 116
4.5.4. Влияние мягкой тепловой предобработки на изменение морфологии ядер у дрожжей S. cerevisiae после обработки тепловым шоком при 45С 117
4.5.5. Влияние мягкой тепловой предобработки на гиперполяризацию ВММ у дрожжей S. cerevisiae при негубительном для клеток коротком тепловом воздействии 45С 118
5. Обсуждение 121
5.1. Тепловой шок вызывает развитие ПКГ в культуре клеток арабидопсиса и дрожжей 121
5.2. Зависимость между синтезом БТШ и развитием ПКГ 130
5.3. Общие и отличительные черты между развитием защитной программы и программы клеточной гибели : 135
5.4. Hsp60 как регулятор развития ПКГ 138
5.5. Ассоциация цитоплазматических БТШ с митохондриями 141
5.6. HsplOl/104, Hsp70, Hspl7,6 как ингибиторы развития ПКГ в растительной и дрожжевой клетках 144
6. Выводы 148
7. Список использованной литературы
