Введение
Глава I. Обзор литературы 13
1.1 Метилтрансфераза Set7/9 — важный регулятор внутриклеточных процессов 13
1.1.1 Структура и каталитический механизм метилтрансферазы Set7/9 14
1.1.2 Многообразие регуляторных функций Set7/9 16
1.1.3 Метилтрансфераза Set7/9 — важный регулятор клеточного цикла и апоптоза 22
1.2 Биологическая роль РНК-связывающего белка Sam68 23
1.2.1 Структура РНК-связывающего белка Sam68 24
1.2.2 РНК - мишени белка Sam68 26
1.2.3 Внутриклеточная локализация Sam68 27
1.2.4 Механизмы регуляции РНК-связывающего белка Sam68 29
1.2.5 Биологические функции Sam68 31
1.2.6 Роль белка Sam68 в контроле клеточного цикла и апоптоза 33
1.2.7 Роль белка Sam68 в онкогенезе 35
Глава 2. Материалы и методы 38
2.1 Клеточные культуры 38
2.1.1 Клеточные линии, использованные в работе 38
2.1.2 Условия культивирования 38
2.1.3 Обработка клеток химическими агентами 38
2.1.4 Трансфекция клеточных линий 39
2.1.5 Получение стабильных клеточных линий 40
2.2 Очистка, выделение и анализ нуклеиновых кислот 40
2.2.1 Выделение РНК и обратная транскрипция 40
2.2.2 ПЦР в реальном времени 41
2.2.3 Выделение плазмидной ДНК 42
2.2.4 Электрофорез в агарозном геле 42
2.2.5 Выделение ДНК из агарозного геля 43
2.3 Генетические конструкции 43
2.3.1 Сайт-направленный мутагенез. 43
2.3.2 Молекулярное клонирование 44
2.4 Экспрессия, очистка и анализ рекомбинантных белков 45
2.4.1 Трансформация E. coli методом теплового шока 45
2.4.2 Экспрессия рекомбинантных белков 46
2.4.3 Очистка рекомбинантных белков с использованием глутатион-сефарозы 46
2.4.4 Очистка рекомбинантных белков с использованием Ni-агарозы 47
2.4.5 Получение цитоплазматического и ядерного экстрактов 48
2.4.6 Разделение белков в ПААГ и иммуноблоттинг (вестерн-блот анализ) 48
2.5 Изучение белок-белковых взаимодействий 50
2.5.1 GST-пулдаун 50
2.5.2 Ко-иммунопреципитация 51
2.6 Иммуноцитохимическое окрашивание 51
2.7 Изучение клеточного цикла методом проточной цитометрии 52
Глава III Результаты 54
3.1 Определение белков-интерактантов метилтрансферазы Set7/9 54
3.2 Подтверждение взаимодействия между метилтрансферазой Set7/9 и РНК связывающим белком Sam68 55
3.2.1 Полноразмерная форма метилтрансферазы Set7/9 взаимодействует с полноразмерной формой Sam68 in vivo 55
3.2.2 Полноразмерная форма Sam68 напрямую взаимодействует с MORN-доменом метилтрансферазы Set7/9 in vitro 57
3.2.3 MORN-домен метилтрансферазы Set7/9 напрямую взаимодействует с RG доменом Sam68 in vitro 58
3.3 Метилтрансфераза Set7/9 метилирует РНК-связывающий белок Sam68 в положении К208. 61
3.3.1 Биоинформатический поиск потенциального сайта метилирования Sam68 61
3.3.2 Сайт-направленный мутагенез потенциального сайта метилирования Sam68 63
3.3.3 Метилтрансфераза Set7/9 метилирует Sam68 в положении K208 64
3.4 Особенности локализации Sam68 в клетках HEK293T и рака толстой кишки HCT116 65
3.4.1 Локализация эндогенного Sam68 в клеточных линиях HEK293T и HCT116 65
3.4.2 Локализация сверхэкспрессированного Sam68 в клетках HEK293T и клетках рака толстой кишки HCT116 68
3.4.3 Цитоплазматический Sam68 ассоциирован с -тубулином микротрубочек 70
3.4.4 Sam68 ассоциирован с формированием апоптотической сети микротрубочек 71
3.5 Роль Set7/9 в регуляции РНК-связывающего белка Sam68 74
3.5.1 Влияние Set7/9 на белковый уровень Sam68 74
3.5.2 Нокаут Set7/9 приводит к снижению уровня Sam68 в цитоплазме 74
3.5.3 Set7/9 оказывает влияние на Sam68-опосредованный сплайсинг Bcl x 78
3.5.4 Метилтрансфераза Set7/9 необходима для Sam68-опосредованной репрессии циклинов D1 и E 80
3.5.5 Роль Set7/9 в Sam68-опосредованной регуляции клеточного цикла 85
3.5.6 Влияние белков Set7/9 и Sam68 на выживаемость пациентов с раком толстой кишки 86
Глава IV Обсуждение 88
4.1 MORN домен метилтрансферазы Set7/9 отвечает за межбелковое взаимодействие с РНК-связывающим белком Sam68 4.2 Sam68 – новый субстрат метилирования метилтрансферазы Set7/9 89
4.3 Цитоплазматическая локализация Sam68 зависит от наличия Set7/9 91
4.4 Set7/9 новый регулятор Sam68-опосредованного сплайсинга Bcl-x 93
4.5 Метилтрансфераза Set7/9 необходима для Sam68-опосредованной регуляции клеточного цикла 94
4.6 Низкий уровень Set7/9 оказывает негативное влияние на выживаемость пациентов с раком толстой кишки 96
Выводы 98
Список литературы 100
Благодарности 111
