Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 14
1.1. Стероидные гормоны и их физиологическая роль в развитии молочной железы 14
1.1.1. Роль эстрогенов в развитии молочной железы 14
1.1.2. Структура рецепторов эстрогенов 14
1.1.3. Механизмы действия стероидных гормонов 16
1.2. Развитие злокачественных опухолей РМЖ 18
1.2.1. Гормональная резистентность 19
1.2.2. Механизмы гормональной резистентности РМЖ 20
1.3. Виды межклеточных взаимодействий и развитие молочной железы 24
1.3.1. Паракринная регуляция 25
1.3.2. Паракринная регуляция и развитие РМЖ 25
1.3.3. Щелевые контакты 27
1.3.4. Роль щелевых контактов в развитии РМЖ 29
1.3.5. Экзосомы как тип межклеточных взаимодействий 30
1.3.6. Участие экзосом в развитии РМЖ 32
1.4. Межклеточные взаимодействия и развитие гормональной резистентности 34
1.4.1. Паракринная коммуникация, как элемент в процессе развития гормональной резистентности 34
1.4.2. Гормональная резистентность и щелевые контакты 35
1.4.3. Экзосомы и их роль в ответе на антиэстрогены 36
1.5. Межклеточные взаимодействия и эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) 37
1.5.1. ЭМП и опухолевый рост 37
1.5.2. Межклеточные сообщения, ЭМП и гормональная резистентность 38
ГЛАВА 2. Материалы и методы 40
2.1. Клеточные культуры 40
2.2. Получение GFP-позитивных сублиний 40
2.3. Клонирование и выведение MCF-7/clone R субпопуляции 41
2.4. Культивирование клеток на культуральных вставках 41
2.5. Определение количества клеток с помощью камеры Горяева 42
2.6. MTT-тест 42
2.7. Выделение экзосом из культуральной среды 42
2.8. Верификация экзосом методом ПЭМ 43
2.9. Получение экстрактов экзосом/клеток и SDS-электрофорез в ПААГ 43
2.10. Иммуноблоттинг 44
2.11. Транзиторная трансфекция 44
2.12. Репортерный анализ 45
2.13. Детекция физиологической активности экзосом 46
2.14. Анализ микроРНК в препаратах экзосом 47
2.15. Статистическая обработка результатов 47
2.16. Список использованных реактивов 47
2.17. Список оборудования 49
ГЛАВА 3. Результаты 50
3.1. Межклеточные взаимодействия и развитие гормональной резистентности рака молочной железы 50
3.1.1. Разработка экспериментальной модели приобретенной гормональной резистентности клеток РМЖ 50
3.1.2. Получение стабильного GFP-позитивного клона гормоннезависимой сублинии MCF-7/T и гормончувствительной MCF-7 52
3.1.3. Влияние совместного культивирования гормончувствительных и резистентных клеток на уровень гормонального ответа. 54
3.1.4. Кондиционированная среда и эффект приобретенной резистентности
3.2. Сравнительный анализ действия ингибиторов сигнальных путей на горизонтальный путь передачи гормональной резистентности 58
3.3. Роль экзосом в развитии приобретенной гормональной резистентности рака молочной железы
3.3.1. Получение и верификация препаратов экзосом 60
3.3.2. Экзосомы и развитие приобретенной гормональной резистентности 62
3.3.3. Сравнительный анализ экзосом родительских и гормонрезистентных клеток 64
3.4. Исследование общих характеристик белкового спектра в резистентных клонах клеток 66
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 69
4.1. Межклеточные взаимодействия и развитие гормональной резистентности рака молочной железы 69
4.2. Роль экзосом в развитии приобретенной гормональной резистентности рака молочной железы 71
4.3. Характеристики белкового спектра в резистентных клонах клеток 72
Заключение 74
Выводы 76
Список литературы 77
