Введение
1. Обзор литературы 18
1.1 Церебральная ишемия и травма головного мозга: этиология и клиническая значимость 18
1.1.1 Ишемический инсульт 18
1.1.2 Гипоксическая энцефалопатия новорожденных 19
1.1.3 ЧМТ 20
1.2 Функциональная роль митохондрий в патофизиологии головного мозга 22
1.2.1 Структура и функции митохондрий в головном мозге 22
1.2.2 Роль митохондриальных АФК в развитии острых церебральных патологий 29
1.2.2.1 Механизмы образования активных форм кислорода 29
1.2.2.2 Сигнальная функция АФК 35
1.2.2.3 Механизмы клеточной защиты от АФК 39
1.2.3 Роль митохондрий в кальциевой сигнализации 44
1.2.4 Митохондрии и глутаматная эксайтотоксичность 48
1.2.5 Роль митохондрий в клеточной гибели 53
1.2.5.1 Переход митохондрий в состояние повышенной проницаемости и индукция клеточной гибели 54
1.2.5.2 Каспаза-зависимый апоптоз 56
1.2.5.3 Каспаза-независимый апоптоз 59
1.2.5.4 Индукторы и модуляторы участия митохондрий в гибели клеток, повышающие проницаемость внешней мембраны 60
1.2.5.5 Окислительный стресс 62
1.2.5.6 Активация PARP 63
1.2.6 Контроль качества митохондрий (митофагия) 63
1.2.7 Повреждение митохондрий как активатор врожденного иммунитета 68
1.3 Стратегии защиты головного мозга 71
1.3.1 Антиоксиданты 71
1.3.2 Разобщители дыхания и окислительного фосфорилирования 75
1.3.3 Прекондиционирование 80
1.3.4 Фармакологическое ингибирование неспецифической проницаемости митохондрий 91
1.3.5 Клеточная терапия 102
2. Материалы и методы экспериментальных исследований 112
2.1 Эксперименты на культурах клеток 112
2.1.1 Получение первичной культуры нейронов 112
2.1.2 Получение первичной культуры астроглии 113
2.1.3 Культивирование эндотелиальных клеток 113
2.1.4 Культуры клеток эпителия почечных канальцев 114
2.1.5 Получение мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток 114
2.1.6 Получение 0 клеток линии PC12 114
2.1.7 Фенотипирование клеточных культур 115
2.1.8 Кислородно-глюкозная депривация (КГД) 115
2.1.9 Химическая гипоксия 116
2.1.10 Оценка жизнеспособности клеточных культур 116
2.1.11 Оценка продукции лактата 116
2.1.12 Измерение активности лактатдегидрогеназы 116
2.1.13 Совместное культивирование клеток эпителия почечных канальцев с первичной культурой нейронов коры головного мозга 117
2.1.14 Сокультивирование ММСК с нейральными клетками 117
2.1.15 Трансфицирование клеток 117
2.1.16 Оценка межклеточного транспорта компонентов цитозоля между ММСК и нейральными клетками 118
2.1.17 Иммуноцитохимия первичных культур нейронов 118
2.1.18 Оценка продукции АФК в первичной культуре нейронов 118
2.1.19 Оценка мембранного митохондриального потенциала в клеточных культурах 118
2.1.20 Оценка пролиферации клеток 119
2.1.21 Конфокальная микроскопия 119
2.1.22 Проточная цитофлуориметрия 119
2.1.23 Обработка клеточных культур цитопротекторными агентами 120
2.2 Эксперименты на животных 120
2.2.1 Моделирование фокальной ишемии/реперфузии головного мозга 121
2.2.2 Моделирование открытой черепно-мозговой травмы головного мозга 121
2.2.3 Моделирование ишемического/гипоксического повреждения головного мозга у новорожденных крысят 122
2.2.4 Поведенческие тесты 122
2.2.4.1 Тест «Постановка конечности на опору» 123
2.2.4.2 Тест Монтойа 124
2.2.5 Магнитно-резонансная томография 124
2.2.6 Протонная магнитно-резонансная спектроскопия 124
2.2.7 Окраска срезов мозга 2,3,5-трифенилтетразолия хлоридом 125
2.2.8 Определение объема инфаркта 125
2.2.9 Определение АФК в срезах головного мозга 126
2.2.10 Оценка трансмембранного митохондриального потенциала в суспензии клеток головного мозга 126
2.2.11 Инъекция ММСК в головной мозг 127
2.2.12 Экспериментальные группы и изучаемые терапетические подходы 127
2.2.12.1 Изучение нейропротеткорных свойств ионов лития 127
2.2.12.2 Исследование нейропротекторных свойств митохондриально адресованных антиоксидантов 128
2.2.12.3 Изучение нейропротекторных свойств разобщителей дыхания и окислительного фосфорилирования 129
2.2.12.4 Изучение нейропротекторных эффектов фармакологического и удаленного ишемичского прекондиционирования 131
2.2.12.5 Оценка нейропротекторных свойств ММСК на модели ишемии головного мозга 134
2.3 Биохимические исследования 134
2.3.1 Определение содержания эритропоэтина в моче 134
2.3.2 Выделение митохондрий 135
2.3.3. Полярографическое измерение потребления О2 митохондриями 135
2.3.4 Вестерн-блоттинг 135
2.4 Статистическая обработка данных 136
3. Результаты 137
3.1 Ишемия/реперфузия вызывает дисфункцию митохондрий клеток головного мозга 137
3.2 Защита головного мозга от повреждений, вызванных ишемией/реперфузией или черепно-мозговой травмой 141
3.2.2 Нейропротекторные свойства митохондриально-адресованных антиоксидантов 158
3.2.3 Нейропротекторные свойства разобщителей дыхания и окислительного фосфорилирования 182
3.2.3.1 Протонофор 2,4-динитрофенол защищает головной мозг от последствий ишемии/реперфузии 182
3.2.3.2 Нейропротекторные свойства митохондриально-адресованных разобщителей дыхания и окислительного фосфорилирования при ишемии/реперфузии головного мозга 184
3.2.3.3 Нейропротекторные свойства грамицидина А с N-концевыми модификациями 186
3.2.3.4 Нейропротекторные свойства митохондриально-адресованного флуоресцеина (MitoFluo) на модели ЧМТ 191
3.2.4 Фармакологическое и удаленное ишемическое прекондиционирование как способ защиты головного мозга при инсульте 197
3.2.4.1 Удаленное ишемическое прекондиционирование почки защищает головной мозг от ишемии/реперфузии 197
3.2.4.2 Нейропротекторный эффект удаленного ишемического прекондиционирования конечностей и влияние на него анестетиков 203
3.2.4.2.1 Нейропротекторный эффект удаленного ишемического прекондиционирования конечностей на экспериментальной модели ишемии/реперфузии головного мозга 203
3.2.4.2.2 Нейропротекторные эффекты УИПК при использовании хлоралгидрата во время прекондиционирования 207
3.2.4.2.3 Нейропротекторные эффекты УИПК при использовании золетила во время прекондиционирования 209
3.2.4.2.4 Исследование сигнальных путей ишемической толерантности, вызванной УИПК и наркозными препаратами 211
3.2.4.3 Нейропротекторный эффект фармакологического прекондиционирования митохондриально-адресованным антиоксидантом SkQR1 213
3.2.5 Терапия ишемии головного мозга мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками 224
3.2.5.1 Фенотип использованных первичных клеточных культур 224
3.2.5.1.1 Фенотипирование мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток 224
3.2.5.1.2 Фенотипирование первичных культур нейронов и астроцитов 225
3.2.5.2 Транспорт компонентов цитозоля между нейральными клетками и ММСК 227
3.2.5.3 Транспорт митохондрий между нейральными клетками и ММСК 235
3.2.5.4 Влияние митохондриальной дисфункции в соматических клетках на донирование митохондрий из ММСК 237
3.2.5.5 Образование межклеточных контактов по типу туннелирующих нанотрубок между нейральными клетками и ММСК 242
3.2.5.6 Влияние сокультивирования ММСК с нейронами на нейропротекторные свойства ММСК 245
3.2.5.7 Роль белка Miro1 в межклеточном транспорте митохондрий и в реализации нейропротекторных эффектов ММСК на модели экспериментальной ишемии головного мозга крысы 249
4. Обсуждение 253
5. Выводы 294
Список литературы 299
Благодарности 346
