Введение
Биолюминесцентные белки.
Механизм биолюминесцентной реакции
Са2+-регулируемые фотопротеины
Пространственная структура Са2+-регулируемых
фотопротеинов
Особенности пространственной структуры
Са2+-разряженного обелина
Возможные пути формирования 2-гидропероксицелентеразина
Функциональная роль остатков His и Tyr в формировании активного фотопротеинового комплекса
Механизм биолюминесцентной реакции Са2+-регулируемых фотопротеинов
Механизм биолюминесцентных реакций других целентеразин-зависимых систем
Материалы и методы
Клонирование, олигонуклеотид-направленный мутагенез
Выделение и очистка мутантов фотопротеина обелина Y138F и F88Y
Получение Са2+-разряженных мутантов обелина Y138F и F88Y со связанным целентерамидом
Получение анаэробного апо-обелин– целентеразинового комплекса
2.5 Определение удельной биолюминесцентной активности, концентрации белка и измерение спектров биолюминесценции
2.6 Измерение спектра поглощения апо-обелин– целентеразинового комплекса
2.7 Кинетические измерения методом остановленной струи (stopped-flow)
2.8 Кристаллография
2.9 Программное обеспечение
2.10 Реактивы
ГЛАВА 3 Пространственные структуры обелина Y138F и Са2+-разряженного обелина Y138F. Каталитическая функция молекулы воды и роль Tyr138 в биолюминесцентной реакции
3.1 Пространственные кристаллические структуры обелина Y138F со связанным 2-гидроперокси-
целентеразином и Са2+-разряженного обелина Y138F
со связанными целентерамидом и ионами Са2+
3.1.1 Кристаллизация
3.1.2 Общая структура белков
3.1.3 «EF-hand» Са2+-связывающие петли
3.1.4 Субстрат-связывающие полости
3.1.5 Спектральные и кинетические свойства обелина Y138F
3.2 Каталитическая функция молекулы воды и роль
Tyr138 в биолюминесцентной реакции
ГЛАВА 4 Пространственные структуры обелина F88Y и Са2+-разряженного обелина F88Y. Структурные основы особенностей спектров биолюминесценции Са2+-регулируемых фотопротеинов 75
4.1 Пространственные кристаллические структуры обелина F88Y со связанным 2-гидроперокси-целентеразином и Са2+-разряженного обелина F88Y со связанными целентерамидом и Са2+ 75
4.1.1 Кристаллизация 75
4.1.2 Общая структура белков 76
4.1.3 «EF-hand» Са2+-связывающие петли 80
4.1.4 Системы водородных связей в лиганд-связывающей полости обелина F88Y до и после биолюминесцентной реакции 81
4.2 Структурные основы особенностей спектров
биолюминесценции Са2+-регулируемых фотопротеинов 89
ГЛАВА 5 Анаэробный апо-обелин–целентеразиновый комплекс. Роль His 175 в процессе формирования активного фотопротеина 95
5.1 Взаимодействие целентеразина с апо-обелином 95
5.2 Спектры поглощения целентеразина в анаэробных условиях при различных рН 96
5.3 Взаимодействие свободного целентеразина с кислородом 97
5.4 Спектральные свойства анаэробного апо-обелин– целентеразинового комплекса. Кинетика превращения апо-обелин–целентеразинового комплекса в активный фотопротеин 99
5.5 Определение ионной формы целентеразина, связанного с анаэробным апо-обелин– целентеразиновым комплексом 104
5.6 His175 как возможный переносчик протона 105
Заключение 109
Выводы 111
Литература
