СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ........................................................................................................ 2
ВВЕДЕНИЕ ................................................................................................................................. 8
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ .................................................................................................. 10
1.1 ДНК-содержащие органеллы растительной клетки.................................................... 10
1.1.1 Функции митохондрий и хлоропластов в растительной клетке ............................ 10
1.1.2 Структурная организация митохондриального генома растений .......................... 11
1.1.3 Структурная организация пластидного генома растений ...................................... 13
1.2 Особенности аппарата экспрессии генов растительных органелл ............................ 14
1.2.1 РНК-полимеразы фагового типа ............................................................................... 14
1.2.2 Происхождение и эволюция RPOT в различных организмах ................................ 15
1.3 Особенности транскрипции генов в растительных митохондриях ........................... 16
1.3.1 Митохондриальные промоторы ................................................................................ 18
1.3.2 Транскрипционные факторы митохондрий ............................................................. 23
1.4 Особенности транскрипции генов в хлоропластах ..................................................... 24
1.4.1 Пластидные промоторы ............................................................................................. 26
1.4.2 Транскрипционные факторы хлоропластов ............................................................. 26
1.5 Роль NEP на ранних этапах развития растения ........................................................... 28
1.6 Взаимодействие генетических систем растительной клетки ..................................... 29
1.6.1 Ядерный контроль экспрессии митогенома ............................................................. 29
1.6.2 Ядерный контроль экспрессии пластидного генома ............................................... 33
1.6.3 Митохондриально-хлоропластные взаимодействия ............................................... 34
1.6.4 Ретроградная регуляция экспрессии ядерных генов у растений ........................... 36
1.7 Особенности структурной организации и регуляции ЭТЦ митохондрий растений 39
1.7.1 Комплекс I. .................................................................................................................. 39
1.7.2 Комплекс II .................................................................................................................. 43
1.7.3 Комплекс III ................................................................................................................ 44
1.7.4 Комплекс IV и цитохром С ........................................................................................ 45
1.7.5 Комплекс V ................................................................................................................. 45
1.7.6 Другие белки-участники ЭТЦ ................................................................................... 46
6
1.7.7 Супрамолекулярная структура систем OXPHOS растений.................................... 47
1.7.8 Модели структурной организации дыхательной цепи ........................................... 50
1.8 Трансгенные растения с измененной экспрессией RPOTmp ..................................... 52
1.9 Заключение обзора литературы .................................................................................... 54
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ .......................................................................................... 56
2.1 Линии Arabidopsis thaliana использованные в работе ................................................ 56
2.2 Биоинформатические методы ....................................................................................... 56
2.2.1 Получение данных методом ДНК-микрочипирования ........................................... 56
2.2.2 Предварительная обработка данных......................................................................... 56
2.2.3 Визуализация диаграмм. ............................................................................................ 58
2.2.4 Анализ ко-экспрессии генов. ..................................................................................... 58
2.2.5 Анализ избыточной представленности и обогащения наборов генов. ................. 59
2.3 Выращивание стерильных растений на чашках Петри .............................................. 59
2.4 Подготовка образцов, экстракция и оценка качества РНК ........................................ 59
2.5 Обратно-транскриптазная ПЦР .................................................................................... 60
2.5.1 Синтез первой цепи кДНК ......................................................................................... 60
2.5.2 Количественная ПЦР в реальном времени .............................................................. 60
2.6 Выделение митохондрий из зеленых проростков арабидопсиса .............................. 61
2.7 Выделение тилакоидных мембран ............................................................................... 62
2.8 Солюбилизация митохондриальных и тилакоидных мембран .................................. 62
2.9 Электрофоретические методы ...................................................................................... 62
2.9.1 Электрофорез ДНК в агарозном геле ....................................................................... 62
2.9.2 Белковый электрофорез ............................................................................................. 63
2.9.3 Определение активности дыхательных комплексов ............................................... 63
2.10 Вестерн-блоттинг ........................................................................................................... 63
2.11 Методы молекулярного клонирования ........................................................................ 64
2.12 Статистическая обработка данных ............................................................................... 66
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ................................................................................ 67
7
3.1 Анализ транскриптома трансгенных линий с измененной экспрессией RPOTmp .. 67
3.1.1 Характеристика профилей дифференциальной экспрессии исследуемых линий 67
3.1.2 Анализ обогащения Генной Онтологии (GO) .......................................................... 69
3.1.3 Анализ обогащения метаболических путей KEGG ................................................. 71
3.1.4 Экспрессия транскрипционных факторов ................................................................ 72
3.1.5 Экспрессия генов, кодирующих белки митохондрий ............................................. 74
3.1.6 Экспрессия генов, кодирующих белки хлоропластов ............................................ 79
3.1.7 Экспрессия маркерных генов органелльных нарушений ....................................... 82
3.1.8 Экспрессия генов PPR-белков ................................................................................... 83
3.1.9 Анализ ко-экспрессии генов ...................................................................................... 84
3.1.10 Анализ скоррелированной экспрессии сетевыми методами .................................. 89
3.1.11 Синтез комбинированных генных сетей .................................................................. 93
3.2 Характеристика прорастания растений линий с гиперэкспрессией RPOTmp ......... 94
3.3 Изучение супрамолекулярной организации дыхательной цепи митохондрий и
хлоропластов в линиях с гиперэкспрессией RPOTmp .......................................................... 97
3.3.1 Характеристика ЭТЦ митохондрий исследуемых линий методом голубого
нативного электрофореза .................................................................................................................... 97
3.3.2 Характеристика супрамолекулярной организаций ЭТЦ митохондрий
исследуемых линий методом двумерного BN/SDS электрофореза .............................................. 100
3.3.3 Характеристика состава суперкомплексов ЭТЦ митохондрий исследуемых линий
методом иммуноблоттинга ................................................................................................................ 102
3.4 Характеристика белковых комплексов тилакоидов исследуемых растительных
линий методом голубого нативного электрофореза ........................................................... 104
3.5 Создание генетических конструкций ......................................................................... 104
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ...................................................................................................................... 109
ВЫВОДЫ ................................................................................................................................ 113
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ .............................................................. 114
ПРИЛОЖЕНИЯ ...................................................................................................................... 150
