Введение
1. Обзор литературы 8
1.1 .Салициловая кислота, общая характеристика 8
1.1.1. История открытия 8
1.1.2. Биосинтез салициловой кислоты 9
1.1.3. Содержание салициловой кислоты в тканях растений 12
1.1.4. Салициловая кислота и защита от биотического стресса 13
1.1.5. Участие салициловой кислоты в сигнальной трансдукции 19
1.1.6. Роль салициловой кислоты в генерации АФК 21
1.2. Роль салициловой кислоты в программируемой клеточной смерти 24
1.2.1. Общие характеристики программируемой клеточной смерти растений и животных 24
1.2.2. Участие салициловой кислоты в реакции сверхчувствительности 28
1.2.3. Роль салициловой кислоты у мутантов со спонтанной клеточной гибелью 30
1.2.4. Программируемая клеточная смерть, вызванная применением экзогенной салициловой кислоты 33
1.3. Явление индуцируемой термотолерантпости 35
1.4. Белки теплового шока 36
1.4.1. Семейство Clp/Hsp 100 37
1.4.2. Белки семейства Hsp90 40
1.4.3. Белки семейства Hsp70 40
1.4.4. Шаперонины (семейство Hsp60) 42
1.4.5. Низкомолекулярные БТШ 43
1.4.6. Регуляция экспрессии БТШ 44
1.5. Взаимодействие между салицилат-опосредованпыми сигнальными путями и ответами на действие повышенных температур 47
1.5.1. Влияние салициловой кислоты на устойчивость к повышенным температурам 50
1.5.2. Влияние салициловой кислоты на синтез БТШ 52
1.5.3. Взаимодействие ответов на действие повышенных температур и атаку патогенов 52
1.6. Роль митохондрий в стрессовых ответах 53
1.6.1. Роль митохондрий в синтезе БТШ 53
1.6.2. Влияние салициловой кислоты на функционирование митохондрий 56
1.7. Выводы из обзора литературы 59
2. Материалы и методы 61
2.1. Объект исследования 61
2.2. Температурные обработки 61
2.3. Обработка клеток салициловой кислотой, ингибиторами и разобщителями ЭТЦ..62
2.4. Методы оценки жизнеспособности клеток 62
2.4.1. Определение жизнеспособности клеток по восстановлению ТТХ 62
2.4.2. Окрашивание мертвых клеток 63
2.5. Выделение суммарного белка 63
2.6. Электрофорез в ПААГе с ДДС-Na 64
2.7. Окрашивание и обесцвечивание гелей 65
2.8. Вестерн-блотинг 65
2.9. Использованные антитела 66
2.10. ОТ-ПЦР-анализ 67
2.10.1. Выделение РНК 67
2.10.2. Денатурирующий РНК электрофорез 67
2.10.3. Синтез кДНК 67
2.10.4. Электрофорез в агарозном геле 68
2.11. Определение дыхательной активности 68
2.12. Микроскопические методы (флуоресцентная и световая микроскопия) 69
2.13. Определение содержания эндогенной салициловой кислоты 69
2.14. Статистическая обработка данных 70
3. Результаты 71
3.1. Влияние экзогенной салициловой кислоты на жизнеспособность культуры клеток Л. thaliana 71
3.1.1. Влияние длительной обработки салициловой кислотой на культуру клеток A. thaliana 71
3.1.2. Действие салициловой кислоты на движение цитоплазмы 75
3.1.3. Действие салициловой кислоты на морфологическую структуру клеток 76
3.1.4. Влияние предобработки мягким тепловым стрессом на жизнеспособность клеток, обработанных салициловой кислотой 77
3.2. Влияние салициловой кислоты на культуру клеток A. thaliana при мягком тепловом стрессе 79
3.2.1. Влияние кратковременной обработки салициловой кислотой на жизнеспособность клеток A. thaliana 79
3.2.2. Влияние салициловой кислоты на развитие индуцированной термотолерантности и синтез БТШ 81
3.3. Влияние салициловой кислоты на функции митохондрий 87
3.3.1 Изменение интенсивности поглощения кислорода в присутствии салициловой кислоты 87
3.3.2. Влияние салициловой кислоты на изменение потенциала внутренней митохондриальной мембраны 89
3.4. Экспрессия стрессовых генов при действии салициловой кислоты и мягкого теплового стресса 91
3.4.1. Действие салициловой кислоты на экспрессию стрессовых генов 91
3.4.2. Изучение экспрессии наметакаспазы МСЗ 94
3.4.2.1. Экспрессия гена МСЗ после инкубации клеток в условиях жесткого теплового шока 94
3.4.2.2. Экспрессия гена МСЗ в условиях мягкого теплового стресса 95
3.4.2.3. Экспрессия гена МСЗ при нарушениях митохондриальных функций 97
3.5. Сравнение динамики изменения потенциала на внутренней митохондриальной
мембране и эндогенного уровня салициловой кислоты при мягком тепловом стрессе .98
4. Обсуждение 101
4.1. Мягкий тепловой стресс способствует защите клеток от летального действия салициловой кислоты 101
4.2. Салициловая кислота вызывает ингибирование индуцируемой термотолерантности 104
4.3. Салициловая кислота активирует экспрессию гена метакаспазы МСЗ 108
4.4. Салициловая кислота посредством действия на митохондрии может менять экспрессию стрессовых генов 114
Выводы 120
Список литературы 121
Приложения 149
