Введение
ГЛАВА1. Обзор литературы 10
1.1. Физиолого-биохимические особенности жизнедеятельности микроорганизмов родов Beggiatoa, Leucothrix, Vulcanithermus 10
1.1.1. Разнообразие типов метаболизма бактерий 10
1.1.2. Органотрофный и литотрофный рост бактерий рода Beggiatoa 11
1.1.3. Эколого-биохимическая характеристика рода Leucothrix 12
1.1.4. Особенности метаболизма термофильных бактерий Vulcanithermus medioatlanticus 14
1.2. Трансформация метаболизма бактерий в различных условияхвнешней среды 15
1.2.1. Влияние химического состава среды 16
1.2.1.1. Роль серных соединений 17
1.2.2. Действие физических факторов 18
1.2.2.1. Влияние кислорода 18
1.2.2.2. Значение давления 19
1.2.2.3. Влияние температуры 20
1.2.3. Адаптивные изменения ферментных систем 22
1.3. Физико-химические и регуляторные свойства малатдегидрогеназы 24
1.3.1. Способы получения высокоочищенных препаратов МДГ 24
1.3.2. Общая характеристика каталитического действия 26
1.3.3. Кинетические параметры 27
1.3.4. Влияние концентрации ионов водорода 29
1.3.5. Влияние интермедиатов и ионов 30
1.3.6. Аллостерическая регуляция 33
1.4. Различные уровни организации МДГ 36
1.5. Влияние температуры на активность фермента 45
1.5.1. Температурный оптимум 45
1.5.2. Термостабильность малатдегидрогеназы 46
ГЛАВА 2. Экспериментальная часть 54
2.1. Цель и задачи исследования 54
2.2. Объекты и методы исследования 55
2.2.1. Объекты исследования 55
2.2.2. Методы исследования ^ 55
2.2.2.1. Состав питательных сред для культивирования микроорганизмов 55
2.2.2.2. Определение активности фермента 56
2.2.2.3. Определение количества белка 57
2.2.2.4. Выделение и очистка малатдегидрогеназы 57
2.2.2.5. Электрофоретические исследования 59
2.2.2.5.1. Аналитический электрофорез 59
2.2.2.5.2. Определение гомогенности ферментных препаратов 59
2.2.2.5.3. Специфическое проявление малатдегидрогеназы 60
2.2.2.5.4. Определение молекулярной массы субъединиц МДГ 61
2.2.2.6. Определение молекулярной массы нативного фермента 61
2.2.2.7. Ингибиторный анализ 62
2.2.2.8. Исследование кинетических характеристик и регуляции активности активности ферментов 62
2.2.3. Статистическая обработка экспериментальных данных 63
2.3. Полученные результаты и их обсуждение 65
2.3.1. Получение гомогенных препаратов МДГ из бактерий родов Beggiatoa, Leucothrix, Vulcanithermus 65
2.3.1.1. Очистка малатдегидрогеназы 65
2.3.1.2. Определение гомогенности ферментных препаратов 71
2.3.2. Четвертичная структура малатдегидрогеназы из изучаемых бактерий 75
2.3.2.1. Определение молекулярной массы нативного фермента 75
2.3.2.2. Молекулярная масса субъединиц МДГ 76
2.3.3. Кинетические и регуляторные характеристики МДГ 81
2.3.3.1. Влияние концентрации ионов водорода 81
2.3.3.2. Определение константы Михаэлиса 84
2.3.3.3. Кооперативные свойства тетрамерной формы малатдегидрогеназы из Beggiatoa leptomitiformis Д-402 90
2.3.3.4. Определение константы субстратного ингибирования 92
2.3.3.5. Влияние интермедиатов и ионов на активность МДГ 94
2.3.4. Изменение субъединичной структуры малатдегидрогеназы у бактерий в различных условиях культивирования 96
2.3.4.1. Четвертичная структура МДГ из Beggiatoa leptomitiformis в условиях разного типа питания 96
2.3.4.2. Влияние типа питания на четвертичную структуру МДГ из бактерий Leucothrix mucor 103
2.3.4.3. Влияние ротенона и итаконата на соотношение димерной и тетрамерной форм МДГ 106
2.3.4.4. Механизм структурных изменений малатдегидрогеназы при воздействии тиосульфата 108
2.3.4.5. Хранение димерных и тетрамерных форм МДГ в присутствии стабилизирующих веществ 108
2.3.4.5. Влияние температуры 112
2.3.4.5.1. Температурный оптимум 112
2.3.4.5.2.Термостабильность 114
Заключение 118
Выводы 122
Список использованных источников 125
