Обзор литературы 12
1. Урокиназа 12
1.1. Структура урокиназы 12
1.2. Структура доменов урокиназы 16
2. Взаимодействие с рецептором 17
2.1. Структура урокиназного рецептора 17
2.2. Комплекс АКФ -УКР 21
3. Урокиназа и гепарин 24
4. Ограниченный протеолиз урокиназы 25
5. Посттрансляционные модификации урокиназы 26
6. Регуляция экспрессии урокиназы : 28
7. Ингибирование урокиназы: ПАИ-1, ПАИ-2, PN-1 28
8. Эндоцитоз урокиназы 30
9. Витронектин 32
10. Интегрины 35
11. Функции урокиназы 37
11.1. Протеолитическая функция комплекса УК -УКР 38
11.2. Адгезия и миграция 41
11.2.1. Протеолиз 41
11.2.2. Крингл-зависимая миграция 42
11.2.3. Разрушение фокальных контактов 45
11.2.4. Сигналинг через GPCR 46
11.2.5. Витронектин 47
11.2.6. LDL-опосредованная миграция 47
11.3. Пролиферация 48
11.4. Апоптоз 49
12. Участие урокиназы в ремоделировании тканей 51
12.1. Рестеноз 51
12.2. Ангиогенез 52
12.3. Рост и метастазирование опухолей 53
Материалы и методы 57
1. Химические реактивы 57
2. Антитела 57
3. Культуральные среды и пластик 57
4. Очистка рекомбинантных форм белков 58
5. Определение концентрации белка в пробах 60
6. ДСН-электрофорез 60
7. Изучение растворимости телец включения в гуанидине 60
8. Очистка ростового домена 61
9. Изменение флуоресценции Тгр при температурной денатурации белка 61
10. Круговой дихроизм 61
11. Флуроресценция белков, меченых с помощью Флуоресцеин-5-малеимид J. 62
12. Иммобилизация белков 62
13. Получение общего клеточного лизата 63
14. Иммуноблоттинг 63
15. Иммуноферментный анализ 64
16. М9 среда 64
17. Получение и очистка белка с изотопным замещением 13NHT 65
18. Очистка комплекса УК -УКР 66
19. Спектроскопия ЯМР 66
20. Клеточные культуры 68
21. Получение белков из эукариотических клеток 68
22. Связывание йодированных рекомбинантных форм урокиназы человека с клетками 69
23. Миграция клеток 69
24. Статистическая обработка результатов 70
Результаты 71
1. Очистка рекомбинантных форм урокиназы человека 71
2. Очистка ростового домена урокиназы 73
3. Изучение вторичной структуры РД, КД, АКФ 76
4. Изучение наличия неспаренных цистеинов в ростовом домене 78
5. Изучение функциональности крингл- и ростового доменов рекомбинантных форм урокиназы 81
5.1. Взаимодействие рекомбинантных форм урокиназы с урокиназным рецептором на поверхности клеток СНО 81
5.2. Хемотактическое действие рекомбинантных форм урокиназы на миграцию гладкомышечных клеток человека 83
5.3. Взаимодействие рекомбинантных форм урокиназы с урокиназным рецептором из клеток U937 84
5.4. Сравнение рекомбинантных форм урокиназы, полученных в Е.СоИ с -формами урокиназы , экспрессируемыми в эукариотических клетках 85
6.ЯМР 87
6.1. Подбор условий для ЯМР 87
6.1.1. Подбор среды 87
6.1.2. Подбор условий роста Е. coli вереде Sinantes 88
6.1.3. Подбор условий очистки белка 90
6.2. Получение комплекса AKO(GZD) - УКР в максимально возможной концентрации 93
6.2.1. Очистка комплекса AK
6.2.3. Повышение концентрации комплекса AK(G/D) - УКР 97
6.2.4. Подбор буфера для ЯМР 99
6.3. Приготовление образцов для ЯМР 101
6.3.1. Урокиназный рецептор 101
6.3.2. АКФ (G/D) 102
6.3.3. Смесь AK
6.4. Спектры ЯМР 105
6.4.1. Отнесение Н, 13С и 15N химических сдвигов рекомбинантного AKO(G/D) 105
6.4.2. Конформация рекомбинантного фрагмента урокиназы в свободном состоянии и в комплексе с рецептором 108
Обсуждение 113
Выводы 118
Список литературы 119
