Введение
1 Литературный обзор 13
1.1 Общие сведения об пиримидинфосфорилазах 13
1.2 История открытия нуклеозидфосфорилазы 14
1.3 Два семейства нуклеозидфосфорилаз 15
1.4 Роль уридинфосфорилазы в биологии и медицине
1.4.1 Экспрессия уридинфосфорилазы в опухолевых клетках. Участие уридинфосфорилазы в метаболизме 5-фторурацила 17
1.4.2 УФ в качестве прогностического фактора при раке молочной железы 20
1.4.3 Защитное действие уридина при ишемии нервной ткани 20
1.4.4 Связь между пиримидиновым метаболизмом и накоплением жиров в печени 21
1.4.5 Окислительно-восстановительная чувствительность УФ 22
1.4.6 Ингибиторы уридинфосфорилазы как перспективные антимикробные и антипаразитические препараты 24
1.5 Биохимическая характеристика уридинфосфорилаз. 25
1.5.1 Общая биохимическая характеристика 25
1.5.2 Специфичность уридинфосфорилазы по результатам химической кинетики 27
1.6 Структура уридинфосфорилазы 32
1.6.1 Общее описание структуры 32
1.6.2 Описание сайта связывания уридинфосфорилазы. 1.6.2.1 Урацил связывающий сайт. 39
1.6.2.2 Рибозо-связывающий сайт 39
1.6.2.3 Фосфат-связывающий сайт 1.7 Структурный аспект субстратной специфичности уридинфосфорилаз 40
1.8 Постановка задачи 45
2 Материалы и методы 46
2.1 Клонирование, экспрессия гена и выделение и очистка VchUPh. 46
2.2 Кристаллизация комплексов VchUPh 49
2.3 Сбор и обработка рентгенодифракционных данных. 53
2.4 Решение и уточнение пространственных структур. 56
2.5 Расчет частичных электрических зарядов атомов 62
2.6 Расчет энергии конформаций субстратов в комплексе с VchUPh и в водном растворе. 63
2.7 Молекулярный докинг, оптимизация геометрии и оценка энергии связывания. 65
3 Результаты и обсуждение 68
3.1 Кристаллическая упаковка молекул 68
3.2 Описание структурной организации VchUPh.
3.2.1 Четвертичная структура молекулы фермента VchUPh 72
3.2.2 Третичная, вторичная и первичная структуры молекулы комплексов VchUPh 76
3.2.3 Ион Na+ 77
3.2.4 Сайты связывания VchUPh. 79
3.3 Конформационные изменения структуры VchUPh при связывании с лигандом. 80
3.3.1 Петля-шлагбаум в структурах комплексов VchUPh. 80
3.3.2 Петля L11 молекулы VchUPh в нелигандированном состоянии. 81
3.3.3 Конформация петли L11 VchUPh при наличии субстратов прямой/обратной реакций в активном сайте энзима. 82
3.3.4 Фосфат-связывающий сайт. Влияние фосфат-аниона на конформацию аминокислотных остатков сайта связывания 85
3.3.5 Состояние активного центра и конформация петли L11 в случае связывания фосфат-аниона. 88
3.3.6 Влияние кристаллической упаковки на конформацию петли L11. 90
3.3.7 Двойные положения -стрендов S5, S8 и петли L5 92
3.4 Структурные аспекты специфичности VchUPh к субстратам прямой реакции 100
3.4.1 Нуклеозид-связывающий сайт в структуре комплекса VchUPh с уридином 100
3.4.2 Нуклеозид-связывающий сайт в структуре комплекса VchUPh с тимидином 102
3.4.3 Механизмы узнавания нуклеозидов молекулой VchUPh и разрыва -N1-гликозидной связи в молекулах субстратов прямой реакции. 103
3.4.4 Структурный аспект влияния 2-гидроксигруппы рибозной компоненты нуклеозидов на скорость ферментативной реакции. 105
3.4.5 Структурный и квантовохимический аспекты влияния 5-метилгруппы пиримидиновой компоненты нуклеозидов на скорость ферментативной реакции. 107
3.5 Структурные и квантово-химические аспекты специфичности VchUPh к субстратам обратной реакции 109
3.5.1 Урацил-связывающий сайт в структуре комплекса VchUPh с урацилом 109
3.5.2 Урацил-связывающий сайт в структуре комплекса VchUPh с тимином 110
3.5.3 Структурный и квантово-химический аспекты влияния 5-метилгруппы азотистых оснований на скорость обратной ферментативной реакции. 111
3.5.4 Влияние химического строения и конформации фуранозного компонента второго субстрата на скорость обратной ферментативной реакции 115
3.5.5 Дополнительные аспекты влияния 5-метилгруппы пиримидиновой компоненты нуклеозидов на напряжение -N1-гликозидной ковалентной связи 116
3.6 Структурные и квантово-химические аспекты специфичности VchUPh к
псевдосубстратам 118
3.6.1 Урацил-связывающий сайт в структуре комплекса VchUPh с 6-метилурацилом 118
3.6.2 Структурный аспект влияния 6-метилгруппы азотистых оснований на возможность прохождения обратной ферментативной реакции 119
3.6.3 Урацил-связывающий сайт в структуре комплекса VchUPh с цитозином. 121
3.6.4 Влияние 4-аминогруппы азотистых оснований на скорость обратной ферментативной реакции 122
3.6.5 Структурный и квантово-химический аспекты влияния атома фтора 5-фторурацила на скорость обратной ферментативной реакции. 113
Выводы 127
Благодарности 130
Список литературы.
