Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. Использование трансгенных растений в качестве продуцентов антител, вакцин и терапевтически ценных белков 10
1.1.1. Синтез биофармацевтических белков в трансгенных растениях 11
1.1.2. Производство антител с помощью трансгенных растений 13
1.1.3. Вакцины на основе трансгенных растений 17
1.2. Синтез гена поверхностного антигена вируса гепатита В в различных растительных системах 20
1.2.1. Вирус гепатита В, этиология вируса и его структурные компоненты 21
1.2.2. Вакцины против гепатита В на основе растений 24
1.2.3. Выбор растительных систем экспрессии и методов трансформации 25
1.2.4. Оптимизация экспрессии HBsAg в рекомбинантных растительных системах 28
1.2.5. Структурная характеристика НВзА, синтезированного в трансгенных растениях 29
1.2.6. Исследования иммуногенности НВэАд, синтезируемого трансгенными растениями 30
1.3. Повышение биологической безопасности трансгенных растений 32
1.3.1 .Получение безмаркерных трансгенных растений 34
1.3.1.1. Использование трансформации растений без селективных маркеров устойчивости 35
1.3.1.2. Метод котрансформации 35
1.3.1.3. Сайт-специфическая рекомбинация 36
1.3.1.4. Метод получения безмаркерных растений с использованием транспозонов 39
1.3.1.5. Использование векторной системы МАТ для получения безмаркерных растений 39
1.3.1.6. Удаление маркерных генов из хлоропластов растений 41
1.4.3аключение 42
2. Материалы и методы 44
2.1. Объекты исследования 44
2.2. Штаммы бактерий и плазмиды 44
2.3. Микр обиологические среды 44
2.4. Среды для культивирования растений 46
2.5. Растворы и буферы 48
2.6. Ферменты, использованные в работе 49
2.7. Выделение, очистка и манипуляции с плазмидной ДНК... 50
2.8. Конструирование плазмид для трансформации растений ... 50
2.9. Введение метки в ДНК 53
2.10. Скрининг рекомбинантных клонов гибридизацией на фильтрах 53
2.11. Гибридизация на фильтрах по Саузерну 54
2.12. Трансформация листовых эксплантов табака 54
2.13. Трансформация семян табака и томата с помощью вакуумной инфильтрации 55
2.14. Выделение суммарной растительной ДНК для ПЦР- анализа 55
2.15. Электрофорез в агарозном геле 57
2.16. ПЦР-анализ ДНК трансгенных растений 57
2.17. Выделение белка из тканей растений 57
2.18. Определение белка в растительных экстрактах 58
2.19. Иммуноферментный анализ 58
2.20. Оральная иммунизация мышей клубнями трансгенного картофеля 60
2.21. Измерение количества антител к HBsAg в сыворотке крови иммунизированных мышей 60
3. Результаты и обсуждение 62
3.1.Получение трансгенных растений, экспрессирующих ген HBsAg под контролем комбинированных агробактериальных промоторов 63
3.2.Оптимизация экспрессии гена HBsAg в трансгенных растениях 70
3.3. Получение безмаркерных трансгенных растений с геном HBsAg 75
3.4. Иммуногенность поверхностного антигена вируса гепатита В, синтезируемого трансгенными растениями картофеля 81
Заключение 86
Выводы 89
Список использованной литературы 90
