Введение
1. Обзор литературы 12
1.1. Антимикробные пептиды и белки в иммунной системе организма 12
1.1.2. Понятие о врождённом и приобретённом иммунитете 12
1.1.2. Антимикробные компоненты нейтрофильных гранулоцитов 15
1.2. АМП: история, структура, классификация 24
1.3. Свойства и механизмы действия АМП 1.3.1. Механизм микробоцидного действия АМП 33
1.3.2. Селективность действия АМП в отношении микробных клеток. Зависимость структура-активность 39
1.3.3. Бактериальная резистентность к АМП 40
1.3.4. Другие биологические свойства АМП 1.4. Проблемы и перспективы практического использования АМП 48
1.5. Многообразие применяемых в клинике антибиотиков: краткий обзор 49
1.6. Наночастицы серебра: антимикробные и цитотоксические эффекты 51
1.7. Антимикробные свойства желчных кислот 54
1.8. Сочетанное действие веществ. Виды взаимодействия и методы их определения 1.8.1. Модели возникновения синергизма 57
1.8.2. Синергизм, антагонизм, аддитивность и потенцирование 58
1.8.3. Независимость Блисса и аддитивность Лёве 59
1.8.4. Математические подходы к изучению сочетанного действия 60
1.8.5. Методы определения характера сочетанного антимикробного действия веществ 64
2. Материалы и методы исследования 66
2.1. Объекты исследования 66
2.1.1. Антибиотические и поверхностно-активные вещества 66
2.1.2. Бактериальные клетки 67
2.1.3. Эукариотические клетки 67
2.2. Выделение и очистка дефенсина HNP-1 из лейкоцитов человека 68
2.2.1. Этапы выделения и очистки дефенсина HNP-1 из лейкоцитов человека 68
2.2.2. Аналитический диск-электрофорез в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях в присутствии додецилсульфата натрия 70
2.2.3. Обращённо-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография 72
2.2.4. Спектрофотометрический метод определения концентрации белка в растворе при помощи коэффициента молярной экстинкции 73
2.3. Методы исследования антимикробного действия веществ на бактериальные клетки 74
2.3.1. Оценка антимикробной активности исследуемых препаратов. Метод серийных разведений в жидкой питательной среде, содержащей микроорганизмы 74
2.3.2. Оценка совместного микробоцидного действия исследуемых антимикробных пептидов и белков и небелковых антибиотических агентов. Серийные разведения по методу "шахматной доски" 76
2.3.3. Фотометрический метод оценки способности препаратов влиять на проницаемость наружной и цитоплазматической мембран E.coli ML-35p для маркерных молекул 78 2.3.4. Флуориметрический метод оценки влияния исследуемых препаратов на дыхательную активность бактерий 82
2.3.5. Полярографический метод оценки влияния исследуемых препаратов на потребление кислорода микроорганизмами 84
2.4. Методы исследования цитотоксического действия веществ на эукариотические клетки 90
2.4.1. Анализ гемолитической активности препаратов 90
2.4.2. Выделение нейтрофилов и мононуклеарных лейкоцитов из цельной периферической крови человека 91
2.4.3. Подсчёт клеток в камере Горяева с использованием витального красителя трипанового синего 93
2.4.4. Оценка цитотоксического действия препаратов в отношении эукариотических клеток. МТТ-тест 94
2.4.5. Оценка доли клеток, вступивших на путь апоптоза и некроза при помощи набора реактивов, содержащего аннексин V 96
2.4.6. Спектрофотометрический метод определения активности каспазы 3 98
2.5. Статистическая обработка данных 100
3. Результаты 101
3.1. Исследование совместного действия АМП и белков нейтрофильных гранулоцитов человека 101
3.1.1. Выделение и очистка дефенсина HNP-1 из лейкоцитов человека 102
3.1.2. Совместное антибактериальное действие АМП и белков нейтрофильных гранулоцитов человека 105
3.1.3. Совместное цитотоксическое действие АМП и белков нейтрофильных гранулоцитов человека 109
3.2. Исследование совместного действия АМП и применяемых в клинике антибиотиков... 111
3.2.1. Совместное антибактериальное действие АМП и конвенциональных антибиотиков 114
3.2.2. Влияние сочетаний АМП и конвенциональных антибиотиков на проницаемость наружной и внутренней мембран E.coli ML-35p 123
3.2.3. Влияние сочетаний АМП и конвенциональных антибиотиков на интенсивность метаболических процессов бактериальной клетки 130
3.2.4. Совместное действие АМП и конвенциональных антибиотиков на эукариотические клетки 136
3.3. Исследование сочетанной антимикробной активности АМП с наночастицами серебра и
особенностей биологического действия их конъюгатов 142
3.3.1. Совместное антибактериальное действие АМП и наночастиц серебра 142
3.3.2. Исследование антибактериальной активности конъюгатов АМП и белков с наночастицами серебра 144
3.3.3. Изучение действия препаратов на наружную и цитоплазматическую мембраны грамотрицательной бактерии E.coli ML-35p 151
3.3.4. Изучение влияния препаратов на интенсивность метаболических процессов бактериальной клетки 153
3.3.5. Оценка влияния препаратов на потребление кислорода бактериальной культурой 154
3.3.6. Оценка цитотоксичности конъюгатов АМП и белков с наночастицами серебра в отношении эукариотических клеток 156
3.4. Исследование совместного антибактериального действия АМП с желчными кислотами и синтетическими детергентами 161
3.4.1. Определение характера совместного антибактериального действия АМП с желчными кислотами и синтетическими детергентами 162
3.4.2. Влияние сочетаний АМП с природными и синтетическими детергентами на проницаемость наружной и внутренней мембран E.coli ML-35p 166
3.5. Исследование сочетанного цитотоксического действия АМП и применяемых в клинике
противоопухолевых препаратов на опухолевые клетки 171
3.5.1. Определение характера совместного цитотоксического действия АМП с противоопухолевыми антибиотиками 171
3.5.2. Исследование характера клеточной гибели при сочетанном действии АМП с противоопухолевыми препаратами на опухолевые клетки 174
4. Обсуждение 177
Заключение 190
Выводы 191
Список сокращений 193
Список литературы 195
