Введение
Глава 1 Антирабические профилактические препараты: от прививки Пастера к современным биотехнологиям 25
1.1 Современные особенности распространения бешенства в мире и Российской Федерации 25
1.2 Антирабические лекарственные препараты в Российской Федерации и за рубежом: достижения и перспективы 28
Глава 2 Актуальные тенденции развития биотехнологии производства противовирусных иммунобиологических лекарственных средств 39
2.1 Культуральные технологии в производстве иммунобиологических противовирусных препаратов 39
2.2 Развитие методов очистки, концентрирования и фильтрации полуфабрикатов на биотехнологических производствах 42
2.3 Современные методические подходы к количественному определению вирусов и антител к ним 46
2.4 Получение лиофилизированных лекарственных препаратов иммуноглобулиновой природы 53
Основная часть 67
Глава 3 Материалы и методы 67
3.1 Материалы 68
3.1.1 Вирусные и бактериальные штаммы 68
3.1.2 Сыворотки и препараты 68
3.1.3 Вирусные антигены 68
3.1.4 Клеточная линия 69
3.1.5 Реактивы, растворы и питательные среды 69
3.1.6 Экспериментальные животные 72
3.1.7 Оборудование и приборы 72
3.2 Методы 76
3.2.1 Биотехнологические методы 76
3.2.2 Вирусологические методы 77
3.2.3 Микробиологические методы 77
3.2.4 Биологические методы 77
3.2.5 Иммунохимические методы 77
3.2.6 Молекулярно-генетические методы 79
3.2.7 Биохимические, физико-химические и биофизические методы 82
3.2.8 Статистические методы обработки результатов исследований 84
Собственные исследования 85
Глава 4 Научно-методические основы технологии масштабного получения производственного штамма фиксированного вируса бешенства «Москва 3253» на клетках перевиваемой линии Vero 85
4.1 Отработка условий адаптации вируса бешенства «Москва 3253» к клеткам перевиваемой линии Vero 85
4.2 Экспериментальное обоснование оптимальных технологических параметров масштабного культивирования вируса бешенства производственного штамма «Москва 3253» на клетках Vero суспензионным и псевдосуспензионным способами в биореакторе 90
4.3 Экспериментальное обоснование оптимальных технологических параметров масштабного культивирования вируса бешенства производственного штамма «Москва 3253» на клетках Vero роллерным способом 96
4.4 Разработка биотехнологических приемов по очистке и концентрированию вирусного материала 102
4.5 Сравнительный анализ эффективности накопления клеток Vero и вируса бешенства «Москва 3253» при масштабном культивировании in vitro 109
4.6 Разработка системы мероприятий по предупреждению контаминации микоплазмами клеточной культуры и готового продукта, полученного с применением культуральных технологий 113
Глава 5 Разработка количественного молекулярно-генетического способа определения in vitro фиксированного вируса бешенства «Москва 3253» в антигенсодержащем материале 120
5.1 Подбор ДНК-мишени, праймеров и зонда 120
5.2 Получение рекомбинантного штамма и набора ПЦР-стандартов для количественной оценки содержания virus fixe «Москва 3253» 125
5.3 Определение содержания вируса бешенства в инактивированном органо-тканевом и культуральном антигенном материале в ПЦР-РВ с использованием разработанных ПЦР-стандартов 127
Глава 6 Совершенствование методических подходов для определения in vitro специфической активности антирабических сывороток и иммуноглобулина 130
6.1 Отработка технологических приемов выделения гликопротеида из virus fixe культурального происхождения для конструирования антигенного диагностикума с наночастицами коллоидного золота 130
6.2 Разработка методических приемов определения активности антирабических сывороток и иммуноглобулина in vitro в дот-иммуноанализе с применением диагностикума на основе гликопротеида вируса бешенства и наночастиц коллоидного золота 135
6.3 Разработка методических приемов определения титра специфических антител в антирабических препаратах в непрямом дот-иммуноанализе с применением диагностикума на основе белка А Staphylococcus аureus и наночастиц коллоидного золота 137
Глава 7 Получение экспериментально-производственных серий гетерологичного антирабического иммуноглобулина с использованием культуральных технологий 140
7.1 Получение антирабических сывороток и иммуноглобулина от продуцентов, иммунизированных культуральным рабическим антигеном 140
7.2 Исследование биологических и физико-химических показателей гетерологичного антирабического иммуноглобулина, полученного с применением культурального антигена, в сравнении с фармакопейными показателями 149
7.3 Разработка производственно-технологической документации на получение гетерологичного антирабического иммуноглобулина с применением культуральных технологий 153
Глава 8 Разработка модульной системы очистки и стерилизации антирабического иммуноглобулина с применением фильтрационных материалов отечественного производства 159
8.1 Изучение целесообразности применения отечественных фильтров патронного и капсульного типов для осветления, депирогенизации и стерилизации раствора антирабического иммуноглобулина 160
8.2 Эффективность внедрения фильтрационной технологии с использованием отечественных фильтров в производство антирабического иммуноглобулина 171
Глава 9 Научно-экспериментальное обоснование получения новой формы выпуска антирабического иммуноглобулина – лиофилизата для приготовления раствора для внутримышечных инъекций 173
9.1 Определение эвтектической температуры и исследование тепловых характеристик антирабического иммуноглобулина 173
9.2 Влияние лиопротекторов различной природы на качество антирабического иммуноглобулина в лиофилизированной форме 179
9.3 Оптимизация технологических параметров лиофильного высушивания гетерологичного антирабического иммуноглобулина и его F(ab )2-фрагментов 183
9.4 Эффективность внедрения оптимизированной технологии лиофильного высушивания антирабического иммуноглобулина 195
9.5 Анализ показателей качества лиофилизатов антирабического иммуноглобулина и его F(ab)2-фрагментов 198
9.6 Изучение стабильности лиофилизированного антирабического иммуноглобулина при длительном хранении 204
Глава 10 Совершенствование системы контроля качества антирабического иммуноглобулина 207
10.1 Разработка стандартного образца предприятия специфической активности антирабического иммуноглобулина из сыворотки крови лошади 207
10.2 Исследование молекулярных параметров антирабического иммуноглобулина и обоснование включения раздела «молекулярные параметры» в спецификацию фармакопейной статьи предприятия 210
Заключение 216
Выводы 230
Список сокращений и условных обозначений 232
Список литературы 236
