Введение
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 13
2.1. История открытия болезни, этиология и мировое распространение РРСС 13
2.2. Таксономия, физико-химическая и молекулярно-генетическая характеристика вируса РРСС 16
2.3. Культивирование вируса РРСС in vitro 18
2.4. Репликация, вирусные белки и патогенез болезни 19
2.5. Биологическая и генетическая вариабельность вируса РРСС 21
2.6. Средства и методы лабораторной диагностики РРСС 23
2.6.1. Прямое обнаружение вирусных антигенов в тканях и органах заражённых животных 23
2.6.2. Изоляция и идентификация вируса РРСС 23
2.6.3. Методы обнаружения вирусного генома 24
2.6.4. Характеристика и диагностическая ценность методов обнаружения вирусспецифических антител 25
2.6.4.1. Иммуно-гистохимические методы анализа 26
2.6.4.2. Методы твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) 26
2.6.4.3. Реакция нейтрализации 27
2.6.4.4. Специфические иммуноглобулины М и диагностическая ценность их обнаружения 28
2.6.4.5. Интерпретация результатов серологических исследований 30
Заключение по обзору литературы 32
3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 34
3.1. Материалы 34
3.1.1. Штаммы и изоляты вируса РРСС 34
3.1.2. Животные 34
3.1.3. Культуры клеток 35
3.1.4. Питательные среды и добавки к ним 35
3.1.5. Специфические иммунные сыворотки 35
3.1.6. Моноклональные антитела 36
3.1.7. Белки и ферменты 36
3.1.8. Матрицы для гель-фильтрации 36
3.1.9. Кислоты, основания, соли 36
3.1.10. Растворители 36
3.1.11. Красители и хромогенные субстраты 36
3.1.12. Детергенты 36
3.1.13. Реактивы 36
3.1.14. Исходные водные растворы 37
3.1.15. Диагностические препараты 38
3.1.16. Оборудование 38
3.2. Методы 39
3.2.1. Получение альвеолярных макрофагов свиньи 39
3.2.2. Выделение вируса РРСС из проб органов заражённых свиней 40
3.2.2.1. Подготовка проб 40
3.2.2.2. Инокуляция исследуемым материалом культур клеток, идентификация вируса 40
3.2.2.3. Титрование вируса РРСС 41
3.2.2.4. Биопроба 41
3.2.3. Определение концентрации белка 42
3.2.4. Приготовление конъюгатов 42
3.2.5. Серологические реакции, иммуногистохимические методы 43
3.2.5.1. Реакция непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ) 43
3.2.5.2. Гистохимический вариант ИФА (ГХ-ИФА) 43
3.2.5.3. Твердофазный вариант ИФА (ТФ-ИФА, ELISA) 43
3.2.6. Обратно-транскриптазная полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР) 45
3.2.6.1. Выделение вирусной РНК 45
3.2.6.2. Синтез кДНК 45
3.2.6.3. Постановка ПЦР 45
3.2.6.4. Электрофорез продуктов ПЦР 46
3.2.7. Статистическая обработка результатов исследований 46
4. Результаты собственных исследований 47
4.1. Репродукция вируса РРСС европейского и американского вариантов в различных культуральных системах in vitro 47
4.2. Экспериментальное воспроизведение РРСС с использованием вируса европейского и американского вариантов 51
4.3. Разработка непрямых вариантов иммуно-гистохимического анализа для обнаружения ранних антител (IgM) к вирусу РРСС 55
4.3.1. Получение IgM интактной свиньи 55
4.3.2. Получение иммуноглобулинов анти IgM свиньи 56
4.3.3. Приготовление конъюгата ФИТЦ- анти- IgM свиньи 57
4.3.4. Приготовление конъюгата ПХ- анти- IgM свиньи 59
4.3.5. Определение активности и специфичности конъюгатов (ФИТЦ- анти-IgM и ПХ- анти- IgM ) для обнаружения антител IgM к вирусу РРСС непрямыми методами иммуно-гистохимического анализа 59
4.4. Разработка метода серологической дифференциации европейского и американского вариантов вируса РРСС и специфических антител.. 62
4.5. Оценка методов обнаружения вируса, генома и специфических антител при экспериментальной РРСС-инфекции 66
4.5 1. Оценка чувствительности тест-систем ОТ-ПЦР для обнаружения РНК вируса РРСС 66
4.5.2. Обнаружение специфических РРСС IgM и IgG в сыворотках крови экспериментально зараженных свиней 69
4.5.3. Сравнительные результаты оценки методов изоляции вируса (АМС), обнаружения генома (ОТ-ПЦР) и специфических антител (РНИФ, ГХ-ИФА, ТФ-ИФА) 72
4.6. Оценка лабораторных методов диагностики РРСС в свинокомплексах с различным эпизоотологическим статусом 75
4.6.1. Серологический скрининг популяций домашних свиней благополучного и неблагополучного свинокомплексов по РРСС 75
4.6.2. Оценка методов лабораторной диагностики РРСС при острой вспышке болезни 80
4.6.2.1. Эпизоотологическая характеристика свинокомплекса 80
4.6.2.2. Динамика инцидентности абортов, клинические симптомы и макроскопические изменения 81
4.6.2.3. Лабораторные исследования 85
4.6.2.4. Результаты лабораторных диагностических исследований 85
4.7. Схема лабораторной диагностики РРСС 88
5. ОБСУЖДЕНИЕ 92
6. ВЫВОДЫ ПО
7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 111
8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 112
ПРИЛОЖЕНИЯ 135
