Введение
1. Цитокины, их значение и применение. 10
1.1. Интерфероны: биологическое значение и применение . 11
1.2.Строение молекулы (3-ИФН. 12
2.Механизм действия р - интерферона. 15
2.1. JAK-STAT путь- главный путь передачи сигнала цитокинов. 15
2.2. Рецептор fl-ИФН, передача сигнала по JAK-STAT пути. 17
2.3. Факторы, активируемые ИФН. 21
3. Применение (3-ифн в клинике. 22
3.1. Механизм действия [3-ИФН при рассеянном склерозе . 22
3.1.1. Влияние на презентацию антигена :/3-ИФН- иммуномодулятор. 23
3.1.2. Роль (3-ИФН в развитии иммунного ответа, влияние на продукцию цитокинов различными клетками иммунной системы. 25
3.1.3. Влияние /3-ИФН на инфильтрацию лимфоцитов ЦНС. 26
4. Использование методов генной инженерии для получения новых иммунно-биологических препаратов . 28
5. Регуляция биосинтеза КФ2. 34
5.1. Транскрипционный активатор, кодируемый геном PHQ4 . 35
5.2. Транскрипционный активатор, кодируемый геном PHQ2. 36
5.3. Белки-регуляторы, кодируемые генами РНО80 и PHQ85. 37
5.4. Белок, кодируемый геном PHQ81. 38
6. Секреция белков у дрожжей saccharomyces serevisiae . 40
6.1. Гликозилирование секреторных белков. 41
6.2. Роль протеолиза в секреции чужеродных белков. 44
7. Экспрессия чужеродных генов в метилотрофных дрожжах рісша pastoris . 46
Материалы и методы. 55
1. МАТЕРИАЛЫ 55
1.1. Список сокращений. 55
1.2. Штаммы. 55
1.3. Плазмиды. 57 1 АУсловия культивирования штаммов. 58
2. МЕТОДЫ. 60
2.1. Трансформация бактерий E.coli. 60
2.2 Трансформация дрожжей плазмидной ДНК. 61
2.3 Выделение плазмидной ДНК из клеток Е. coll. 61
2.4. Методы молекулярного клонирования. 62
2.5 Электрофорез фрагментов ДНК. 62
2.6. Выделение фрагментов ДНК из агарозных гелей. 62
2.7. Выделение хромосомной ДНК из дрожжей. 62
2.8. Количественное определение активности кислых фосфатаз. 63
2.9. Определение концентрации белка. 63
2.10. Электрофорез белков в полиакриламидном геле в присутствии додецилсулъфата натрия. 64
2.11. Иммуноблотинг. 64
2.12. Гель-фильтрация на сефакриле S(300) и сефарозе 6В. 65
2.13. Определение биологической активности (3-ИФН. 65
2.14. Определение нуклеотидной последовательности (секвенирование) молекул ДНК. 66
2.15. Полимеразная цепная реакция. 66
2.16. Количественное определение активности р^-галактозидазы 67
2.77. Определение удельной активности цитохром-С-оксидазы. 61
2.18 Выделение митохондрий из дрожжей. 68
Результаты. 69
1 .Получение рекомбинантной плазмиды PHBI. 69
2.Создание штамма дрожжей saccharomyces cerevisiae - продуцента р-интерферона человека. 74
2.1. Характеристика штаммов реципиентов. 74
2.2. Измерение удельной активности КФ штаммов-реципиентов. 76
2.3. Получение штаммов-продуцентов и определение синтеза
В-ИФН человека клетками S.cerevisiae. 77
2.4. Анализ частоты потери плазмиды рНВІ штаммами-продуцентами В-ИФН человека. 78
2.5. Сравнение кривых роста штаммов-реципиетов и продуцентов. 79
2.6. Сравнение диплоидного и гаплоидного штаммов-продуцентов. 79
З.Влияние синтеза в-интерферона на метаболизм клетки S.Cerevisiae. 83
3.1. Сравнение уровня экспрессии гена HSP82 у исходного штамма и штамма-продуцента В-ИФН. 84
3.1.1. Получение плазмиды pRS426-beta . 84
3.1.2. Измерение активности В-галактозидазы у штамма-реципиента и штамма, несущего плазмиду pRS426-beta. 87
4. Разработка схемы очистки рекомбинантного интерферона-в, синтезированного в дрожжах S.Cerevisiae. 89
5.Создание рекомбинантной плазмиды phif, обеспечивающей экспрессию гена в-ифн человека и секрецию рекомбинантного белка дрожжами рісша pastoris. 95
5.1. Создание вектора экспрессии pHIF. 95
5.2. Определение нуклеотидной последовательности амплифицированного гена (3-ИФН человека. 98
5.3. Создание вектора экспрессии, обеспечивающего синтез нативного [3-ИФН человека (pHIF2). 102
6. Создание штаммов дрожжей pichia pastoris- продуцентов р-ифн человека . 105
6.1. Трансформация штамма GS115 генетическими конструкциями, содержащими ген (3-ИФН и селекция трансформантов. 105
6.2. Подбор условий культивирования трансформантов, индукции синтеза и секреции рекомбинантного (3-ИФН человека. 107
6.3. Определение наличия углеводного компонента в составе молекулы Р-ИФН человека, секретируемого клетками P. pas tor is. 109
6.4. Определение уровня продукции (3-ИФН человека штаммом дрожжей P.pastoris. Ill
7. Разработка схемы очистки рекомбинантного р-ифн человека, секретируемого клетками дрожжей pichia pastoris. 111
Оценка влияния замен АК в последовательности Б-ИФН человека на биологические функции рекомбинантного белка. 115
8. Получение штамма продуцента дрожжей p.pastoris обеспечивающего внутриклеточный синтез рекомбинантного р-ифн человека . 116
8.1. Создание вектора экспрессии рЬПУВ и получение штамма продуцента, обеспечивающего внутриклеточный синтез 3-ИФН. 116
8.2. Оценка уровня продукции рекомбинантного (З-ИФН человека штаммом GS115/рШУВ. 118
Обсуждение. 121
Выводы. 138
Список литературы
