Введение
1. Актуальность проблемы 6
2. Цели и задачи работы 8
3. Научная новизна 9
4. Обзор литературы 10
4.1. Селекция капусты белокочанной. Сорта и гибриды 10
4.2. Трансгеноз как новый метод селекции растений 12
4.2.1. Трансформация Brassica oleracea сегодня 12
4.2.2. Техника трансформации 13
4.2.3. Маркерные гены 13
4.2.4. Регуляторныс последовательности 16
4.2.5. Агробактериальная трансформация 17
4.2.6. Прямой перенос генов 20
4.2.7. Наследование трансгенов у генетически модифицированных растений 21
4.3. . Факторы, влияющие на эффективность трансформации 23
4.3.1. Бактериальные штаммы и генотип растений 23
4.3.2. Тип экспланта 24
4.3.3. Оптимальные условия ко-культивирования 26
4.3.4. Отбор трансформированных клеток 29
4.3.5. Регенерация и снижение стрессовых факторов 33
4.3.6. Характеристика трансформантов и экспрессия трансгеиов 36
4.4. Исследование геномного окружения сайтов интеграции Т-
ДНК 37
4.4.1. Метод обратной ПЦР (Inverse PCR) 39
4.4.2. Метод быстрой амплификации геномных окончаний (Rapid
amplification of genomic ends - RAGE) 40
4.4.3. TAIL-PCR 41
AAA. Метод AL-PCR (adaptor ligation PCR) 43
5. Материалы и методы 45
5.1. Линии капусты, использованные в работе 45
5.2. Методы ведения культуры in vitro 45
5.2.1. Стерилизация семян 45
5.2.2. Среды, использованные в работе для поддержания растений культуры in vitro и трансформационного процесса 45
5.2.3. Состав и методика приготовления компонентов питательных сред 46
5.2.4. Определение оптимальной концентрации селективного агента 47
5.2.5. Подбор концентрации селективного агента для анализа поколений трансгенных растений 47
5.2.6. Обработка проростков поколения ТІ раствором гербицида «Баста» 48
5.3. Создание вектора рВаг на основе нлазмиды рВІВаг 48
5.3.1. Методика выделения плазмидной ДНК 48
5.3.2. Рестрикция вектора 49
5.3.3. Выделение фрагмента ДНК из агарозного геля 49
5.3.4. Лигирование вектора 49
5.3.5. Методика приготовления компетентных клеток 49
5.3.6. Трансформация E.coli лигированным вектором 50
5.3.7. Трехродительская конъюгация 50
5.4. Культура агробактерии 50
5.4.1. Бактериальные штаммы и плазмиды 50
5.4.2. Состав и способы приготовления среды для культивирования агробактериальных штаммов 51
5.4.3. Наращивание агробактериалыюй культуры для трансформации 51
5.5. Статистический анализ 51
5.5.1. Дисперсионный анализ однофакторного опыта 52
5.5.2. Наименьшая существенная разница 53
5.5.3. Оценка соответствия между наблюдаемыми и ожидаемыми (теоретическими) распределениями по критерию %2 53
5.6. Методика выделения растительной ДНК 54
5.7. Методика проведения ПЦР 55
5.7.1. Состав реакционной смеси для ПЦР: 55
5.7.2. Анализ продуктов ПЦР 55
5.8. Методика проведения дот-блот гибридизации 56
5.9. Методика проведения AL-PCR 57
5.9.1. Рестрикция геномной ДНК 57
5.9.2. Конструирование специфических адаптеров и дотирование адаптеров с рсстрикциоиной смесью 57
5.9.3. Проведение ПЦР 57
5.9.4. Выделение продуктов ПЦР из агарозного геля 58
5.9.5. Клонирование и секвенирование продуктов ПЦР 58
6. Результаты 60
6.1. Конструирование вектора рВаг для трансформации капусты белокочанной 60
6.2. Разработка схемы селекционного процесса с участием трансгенной составляющей 61
6.3. Получение трансгепных растений капусты белокочанной, устойчивых к гербициду фосфинотрицину 63
6.3.1. Изучение регенерационной способности различных типов эксплантов 63
6.3.2. Изучение влияния фитогормонов на регенерационную способность линий капусты белокочанной 64
6.3.3. Определение оптимальной концентрации селективного агента 68
6.4. Первичный молекулярный анализ трансгенных растений капусты белокочанной 70
6.4.1. Выявление наличия гена bar в геноме растений капусты белокочанной при помощи ПЦР-анализа 70
6.4.2. Выявление наличия гена bar в геноме растений капусты белокочанной при помощи дот-блот гибридизации 71
6.4.3. Трансформация четырех линий капусты белокочанной 73
6.5. Определение количества копий трансгенной вставки методом AL-PCR 74
6.5.1. Амплификация геномной ДНК, фланкирующей Т-ДПК с 5 конца (правая граница Т-ДНК) 74
6.5.2. Амплификация геномной ДНК, фланкирующей Т-ДНК с 3 конца (левая граница Т-ДНК) 79
6.6. Анализ первого семенного поколения трансгенных растений....82
6.6.1. Расщепление в первом семенном поколении от самоопыления трансгенного растения 82
6.6.2. Расщепление в первом семенном поколении от скрещивания трансгенного растения со стерильной родительской формой 83
6.7. Анализ первого семенного поколения трансгенных растений на проявление признака устойчивости в условиях in vivo 85
7. Выводы 88
8. Список литературы 89
Список ИЛЛЮСТРАЦИЙ
Рис. 1 Генетическое родство видов Brassica 12
Рис. 2 Схема проведения обратной ПЦР 40
Рис. 3 Схема проведения TAIL - ПЦР 42
Рис. 4 Схема проведения AL-PCR 44
Рис. 5 Специфические праймеры на область Т-ДНК для проведения
AL-PCR 58
Рис. 6. Рестрикционный анализ дериватов рВШаг (негатив) 60
Рис. 7. Карта вектора рВаг 61
Рис. 8. Схема селекционного процесса трансгенных растений для получения промышленных гибридов с ЦМС, устойчивых к гербицидам на основе фосфинотрицина 62
Рис. 9. Подбор оптимального типа экспланта для регенерации 64
Рис. 10. Подбор оптимальной концентрации селективного агента 69
Рис. 11. Подбор концентрации селективного агента для проростков 69
Рис. 12 Электрофоретический анализ продуктов ПЦР в 1% агарозном геле 71
Рис. 13 Пример анализа растений - регенсрантов методом дот-блот гибридизации 72
Рис. 14 Электрофоретический анализ второй ПЦР на ДНК, обработанной рестриктазами EcoR V, Dra I, Нра I, Zrm I и Ssp I с праймерами API и RB2 76
Рис. 15. Результат скрининга рекомбинантов 77
Рис. 16. Секвенированная последовательность фрагментов, полученных при рестрикции эндонуклеазами EcoR V и Hpal 77
Рис. 17. Теоретическая схема отжига праймеров и проведения ПЦР 79
Рис. 18. Электрофоретический анализ данных второй ПЦР на ДНК, обработанной рестриктазами Zrm I, EcoR V, Нра I, Dra I и Ssp I с праймерами API и LB5 80
Рис. 19 Отбор трансгенных проростков на селективной среде в поколении Ті 85
Рис. 20 Отбор трансгенных проростков ио устойчивости после обработки 1,5 % раствором гербицида «Баста» 86
